脑木耳损伤弧菌免疫应答的体内研究
p . Vijayalakshmi1＊, k Revathi2, k Moorthy1和Azad Ismail Saheb3.
http://dx.doi.org/10.12944/CWE.6.1.31
用福尔马林灭活的创伤弧菌对患病乌鱼(Mugil cephalus L.)的启动组和增强组幼鱼进行免疫。用血清凝集试验评估体液免疫反应。本实验旨在比较启动剂量和增强剂量下的抗体滴度。结果表明，21dpp时的启动响应和35dpp时的助推响应均较高。肌肉内注射比腹腔内注射更适合诱发首发反应。
免疫反应;创伤弧菌;Mugil Cephalus幼鱼;凝集滴定度
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维贾那拉赫什米P，雷瓦希K，摩尔西K，萨赫伯A.I.。脑猴对创伤弧菌免疫应答的体内研究。Curr World environment 2011:6(1);195-200 DOI:http://dx.doi.org/10.12944/CWE.6.1.31
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维贾那拉赫什米P，雷瓦希K，摩尔西K，萨赫伯A.I.。脑猴对创伤弧菌免疫应答的体内研究。世界环境学报2011:6(1);195-200。可以从://www.a-i-l-s-a.com/?p=1325
简介
水产养殖在世界范围内迅速发展，在许多国家，鱼是动物蛋白质的主要来源。人口开发与工业发展。我们的生态系统受到严重污染，对鱼类和其他水生动物造成了相当大的压力。
水产养殖系统中疾病暴发的发生可归因于许多原因。对宿主、病原体和环境之间错综复杂的平衡缺乏了解是最明显的。这些条件，导致生物体更容易感染。由此产生的信息形成了疫苗开发的基线。Ogbulie(1998)研究了化疗药物对养殖鱼类弧菌病的控制效果。抗生素经常被用于可以治愈疾病，但产品中总是有细菌产生耐药性和残留的风险(Fjalestad)et al .,1993)。
鱼类病原体耐药性的发展经常被报道(Aoki, 1992)。病毒病一直是人们关注的主要原因，特别是在微咸水和海洋水产养殖系统中。创伤弧菌是海洋和半咸水中的鱼类病原体之一(Thampuran等, 1998)。接种疫苗的第一次尝试是Hayashi提供的et al .,(1964年)准备预防的疫苗弧菌。Collado等．(2000)研究了不同疫苗对弧菌病引起的有效性创伤弧菌欧洲鳗鲡的2型生物。可用商业疫苗预防弧菌病。各种研究表明，已对几种物质进行了预防细菌性疾病的试验，包括全细胞细菌(Fukuds & Kusuda, 1981年)、减毒活疫苗(Kusuda and Hamaguchi, 1988年)、脂多糖提取物(Fukuda和Kusuda, 1982;1985)。脂质体疫苗(久须田et al .,1988年)和含毒全细胞疫苗(Magarinos)et al .,1994年)，尽管在实验室试验中有效，但它们在水产养殖场中并不十分有效。
在本研究的疫苗接种Mugil领着反对弧菌隔离和顺向对几种抗体滴度进行了分析。
材料和方法
实验动物的收集和维护
幼鱼(6-10厘米)灰鲻鱼(Mugil领着，蝇科)采自本地穆图卡杜、CIBA、金奈及其周围的水体。它们被保存在容量为500升的大型玻璃钢(玻璃钢增强塑料)罐中。在研究期间，水的理化参数，温度范围为27°±27.5°，pH值为7.4±7.4，保持良好。
孤立的细菌
这种细菌是从自然感染的鱼类中分离出来的。对感染的濒死鱼进行鉴定，无菌取样进行细菌培养。将采集的血液、肾脏组织等接种于Zobell海洋琼脂、碱性蛋白胨水、柠檬酸硫代硫酸盐胆盐蔗糖(TCBS)琼脂等合适的培养基中。进一步的鉴定性状用柏吉确定细菌学法进行。
制备的疫苗
福尔马林灭活细菌弧菌本文描述采用标准法制备。Lillehang(1989)，培养接种的碱性蛋白胨水以10,000 rpm离心15分钟，并用无菌磷酸缓冲盐水(PBS)冲洗三次。最后的颗粒在PBS中重悬至109CFU /毫升。用标准板法计算细胞密度。然后将细菌悬浮液连续稀释至107－109CFU /毫升。用0.5%福尔马林灭活悬浮液24小时。如前所述，用离心法收集失活悬浮液。
免疫的鱼
鱼被维持在两组即，每稀释(106, 107,108CFU/ml)，以评估不同剂量的细菌在初级和强化应用的效果。创伤弧菌疫苗通过肌肉内注射注射。每次稀释取36尾鱼进行免疫，每组约18尾鱼，共3个重复，分别为Primed (6x3)、Booster (6x3)肌肉注射各自稀释后的菌悬液0.1 ml。对照组鱼肌肉注射无菌PBS 0.1 ml /鱼。实验期间每天更换水。三组鱼分别于注射0、7、14、20 dpi后零日采样进行血清抗体分析。以含相同数量的细菌悬浮液的21 dpi剂量给强化组的鱼。
凝集滴定度
每隔7天，从零dpi开始，选择10条鱼。死者的血液样本Mugil领着经尾静脉采集后麻醉(苯坐卡因10 ppm)。让血液凝结，并在4°温度下储存一夜。血清经6000转/分离心分离10分钟，50°灭活30分钟。
将无菌PBS (pH 7.2)添加到96孔“U”底微量滴定板(Tarson India Ltd.)的每孔中(50ml)。1圣孔中加入灭活血清100 ml。从1圣将50ml灭活血清转移至2nd好。这种连续稀释一直持续到11年th好。最后一孔无血清作为阴性对照。后来,灭活创伤弧菌暂停(108每孔(50ml)加入CFU/ml，室温下4℃孵育1小时过夜。以最后一次凝集的血清稀释度作为滴定度估计的终点。每条鱼的凝集滴度用对数表示2基于视觉观察的值(Sundick和Rose, 1980)。
统计分析
根据Snedecor和Cochram(1968)对血清凝集滴度进行方差分析。
这是用来评估应用的疗效，以评估特异性免疫记忆(Nosal等．1965)。初级反应中相应时刻的滴定度。这个公式是,
Mf = s (x) -s (o) / p (x)
在哪里
S (X) -升压后X天升压组的滴度
S (O)滴度在给药当日和
P (X) -加药组在加药后X天的滴度。
结果与讨论
自然感染的幼体Mugil领着在本质上是迟缓和坏死的。大多数感染的鱼出现了出血性斑点、疖子和体表发黑。所有的原代培养基都产生相应的菌落形态。生化反应证实该物种为创伤弧菌．
表1和表3显示了原发性和增强免疫反应Mugil领福尔马林处理创伤弧菌．启动组10821 dpp时CFU/ ml为7.6±0.55(抗体滴度)。14天内急剧上升，高剂量后稳定。21天后，初效降至(5.4±0.55)。在增强免疫反应中，抗体滴度在35ddb时较高，为11.6±0.55。
表2、4为方差分析计算的统计分析。单因素方差分析(ANOVA)检验剂量和启动助推剂后天数的差异显示组间差异极显著。统计分析显示，在第一次和强化反应的剂量和持续时间之间有显著差异(P >0.05)Mugil领对intra-muscularlly注入创伤弧菌．
结果显示对注射有明显的渐进阳性反应。结果表明，注射法、福尔马林处理的抗原在21 dpp上有较高的滴度，在35 dpp上有较高的二级反应。但在高剂量时，14天后的反应达到峰值并趋于稳定。挂et al。(1997)证明了佐剂和助推剂注射对鳗鱼抗体产生的影响。强化注射可引起更高的抗体滴度。本研究还表明，二抗应答水平与一次剂量呈正相关。通常助推器反应在I后的较早一天达到较高的峰值圣注入。
表1:免疫Mugil领与福尔马林灭活创伤弧菌(主剂)
| 民进党* | 稀释 | ||
| 日志6 | 日志7 | 日志8 | |
| 0 | 0.6±0.55 | 0.6±0.55 | 0.8±0.45 |
| 7民进党 | 3.0±0.70 | 4.4±0.55 | 5.8±0.45 |
| 14民进党 | 4.6±0.55 | 5.2±0.45 | 7.4±0.55 |
| 21日民进党 | 6.2±0.45 | 6.6±0.55 | 7.6±0.55 |
| 28日民进党 | 5.4±0.55 | 5.8±0.45 | 5.4±0.55 |
| 35民进党 | 5.4±0.55 | 5.4±0.55 | 5.8±0.45 |
| 42民进党 | 4.6±0.55 | 5.0±1.00 | 5.8±0.45 |
启动后*天
表5显示了不同稀释度下的记忆因子结果。为实验计算的记忆因子用于评估助推器应用的效果和评估特异性免疫记忆。MF结果与抗体反应结果基本一致。最高的记忆因子为0.88Mugil领注射107CFU/鱼21dpb。
表2:启动反应剂量和持续时间差异检验显著性的方差分析m .领对腹腔内注射创伤弧菌
| 总结 | 数 | 总和 | 平均 | 方差 |
| 0 ddp | 3. | 2 | 0.66 | 0.01 |
| 7 ddp | 3. | 13.2 | 4.44 | 1.96 |
| 14 ddp | 3. | 17.2 | 5.73 | 2.17 |
| 21 ddp | 3. | 20.4 | 6.8 | 0.52 |
| 28 ddp | 3. | 16.6 | 5.53 | 0.05 |
| 35 ddp | 3. | 16.6 | 5.53 | 0.05 |
| 42 ddp | 3. | 15.4 | 5.13 | 0.37 |
| 106 | 7 | 29.8 | 4.25 | 3.6 |
| 107 | 7 | 33 | 4.71 | 3.76 |
| 108 | 7 | 38.6 | 5.51 | 5.06 |
| 的变异来源 | 党卫军 | df | 女士 | F | 假定值 | F暴击 |
| 行 | 69.88 | 6 | 11.64 | 30.2 | 1.43 e-06 | 2.99 |
| 列 | 5.66 | 2 | 2.83 | 7.35 | 0.008 | 3.88 |
| 错误 | 4.62 | 12 | 0.38 | - | - | - |
| 总计 | 80.18 | 20. | - | - | - | - |
表3:免疫Mugil领用福尔马林灭活创伤弧菌(剂)
| 民进党* | 稀释 | |||||
| 日志6 | 日志7 | 日志8 | ||||
| 0 | 0.6 | 0.55 | 0.8 | 0.45 | 1 | 0.7 |
| 7民进党 | 3.4 | 0.55 | 4.6 | 0.55 | 5.2 | 0.45 |
| 14民进党 | 5 | 0.7 | 5.4 | 0.55 | 7.6 | 0.55 |
| 21 dpb | 6.2 | 0.45 | 6.8 | 0.45 | 7.6 | 0.55 |
| 28 dpb | 7.4 | 0.55 | 8.2 | 0.45 | 10.2 | 0.45 |
| 35 dpb | 8.8 | 0.45 | 10.2 | 0.45 | 11.6 | 0.55 |
| 42 dpb | 9.2 | 0.45 | 11 | 1 | 12.4 | 0.55 |
dpb-日后增强器
用凝集试验评估体液免疫反应的疫苗试验。抗体滴度试验表明，免疫鱼经一、二次注射免疫后，抗体滴度较高。
疫苗的注射确保了每条鱼都能得到恒定和精确剂量的产品。Alexander(1980)和Harris(1973)报道肌肉注射比提供最佳保护的方法更适合诱导初级反应，比浸泡和沐浴接种法更有益。
表4:启动反应剂量和持续时间差异检验显著性的方差分析m .领对腹腔内注射创伤弧菌
| 总结 | 数 | 总和 | 平均 | 方差 |
| 0民进党 | 3. | 2 | 0.66 | 0.01 |
| 7民进党 | 3. | 13.2 | 4.4 | 0.84 |
| 14民进党 | 3. | 18 | 6 | 1.96 |
| 21 dpb | 3. | 20.6 | 6.86 | 0.49 |
| 28 dpb | 3. | 25.8 | 8.6 | 2.8 |
| 35 dpb | 3. | 30.6 | 10.2 | 1.96 |
| 42 dpb | 3. | 32.6 | 10.87 | 2.57 |
| 10 jun | 7 | 40.6 | 5.8 | 9.45 |
| 10-Jul | 7 | 46.8 | 6.68 | 12.7 |
| 10-Aug | 7 | 55.6 | 7.94 | 15.7 |
| 的变异来源 | 党卫军 | df | 女士 | F | 假定值 | F暴击 |
| 行 | 223.63 | 6 | 37.273 | 121 | 4.96平台以及 | 2.9961 |
| 列 | 16.23 | 2 | 8.116 | 26.4 | 4.02 e-05 | 3.8852 |
| 错误 | 3.687 | 12 | 0.307 | - | - | - |
| 总计 | 243.55 | 20. | - | - | - | - |
表5:免疫者的免疫反应和记忆因子(mf) Mugil领 不同剂量的福尔马林灭活剂创伤弧菌
| 民进党/ | 10 jun | 10-Jul | 10-Aug | 曼氏金融 | |||||
| 菲律宾 | 启动 | 升压 | 启动 | 升压 | 启动 | 升压 | 10 jun | 10-Jul | 10-Aug |
| 0民进党 | 0.6±0.55 | 0.6±0.55 | 0.6±0.55 | 0.8±0.45 | 0.8±0.45 | 1.0±0.70 | - | - | - |
| 7民进党 | 3.0±0.70 | 3.4±0.55 | 4.4±0.55 | 4.6±0.55 | 5.8±0.45 | 5.2±0.45 | - | - | - |
| 14民进党 | 4.6±0.55 | 5.0±0.70 | 5.2±0.45 | 5.4±0.55 | 7.4±0.55 | 7.6±0.55 | - | - | - |
| 21 dpb | 6.2±0.45 | 6.2±0.45 | 6.6±0.55 | 6.8±0.45 | 7.6±0.55 | 7.6±0.55 | - | - | - |
| 7 dpb | 5.4±0.55 | 7.4±0.55 | 5.8±0.45 | 8.2±0.45 | 5.4±0.55 | 10.2±0.45 | 0.22 | 0.276 | 0.481 |
| 14 dpb | 5.4±0.55 | 8.8±0.44 | 5.4±0.55 | 10.2±0.45 | 5.8±0.45 | 11.6±0.55 | 0.48 | 0.066 | 0.69 |
| 21 dpb | 4.6±0.55 | 9.2±0.45 | 5.0±1.00 | 11.0±1.00 | 5.8±0.45 | 12.4±0.55 | 0.65 | 0.88 | 0.828 |
dpb-日后增强器
接种疫苗的鱼似乎比未接种疫苗的鱼生长和存活得更好。此外，广泛使用抗生素是不可取的，因为耐药菌株的发展和可能对水环境的不利影响。因此，研究清楚地表明，有效的疫苗开发必将有助于水产养殖业生产出无病鱼。
确认
作者感谢泰米尔纳德邦穆图卡杜市金奈市的印度政府提供的实验室设施和鼓励。
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