酶法水解棉花秸秆生产生物乙醇:可持续能源发展的一条途径
米尔扎·扎希尔·贝格1＊和Smita M. Dharmadhikari1
1奥兰加巴德政府科学研究所微生物系，印度431004
http://dx.doi.org/10.12944/CWE.9.3.46
棉秆的木质纤维素特性有利于作为可再生材料用于各种商业用途。本研究旨在评价棉花秸秆生产生物乙醇的潜力。为此，对棉秆进行了预处理、水解和发酵等一系列处理。结果表明，物理预处理后的棉秆，在2%的碱性溶液中，温度为121℃o用100 CMC单位的酶进行酶解，释放0.49 g/g的糖和24.5 g/L的生物质。此外，当它进入发酵使用共培养酿酒酵母和Pachysolen tannophilus当乙醇浓度为9.56 g/L时，生物质产量为0.191 g/g，纤维素产量为0.298 g/g，可发酵糖产量为0.392 g/g，发酵效率和糖消耗效率分别为76.85%和97.81%。
棉花秸秆;生物乙醇;预处理;水解;发酵
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杨明忠，王晓明，王晓明，等。酶法水解棉花秸秆生产生物乙醇的研究进展。当代世界环境2014;9 (3)DOI:http://dx.doi.org/10.12944/CWE.9.3.46
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杨明忠，王晓明，王晓明，等。酶法水解棉花秸秆生产生物乙醇的研究进展。当代世界环境，2014;9(3)。可以从://www.a-i-l-s-a.com/?p=6821
介绍
世界范围内能源需求的增加和化石储量的减少使得替代燃料的开发重新兴起，替代燃料必须是可再生的和环保的。与化石燃料不同，乙醇是通过糖发酵产生的可再生能源。乙醇可以从各种生物质和各种生物质之间生产;木质纤维素生物质资源是一种丰富而经济的资源，可以作为大规模生产乙醇的来源。1木质纤维素生物质资源包括:农业废弃物、工业废弃物、林业废弃物和城市固体废弃物等。2棉花收获后留下的棉花秸秆是木质纤维素农业废弃物的一个例子。全世界棉花可种植面积约为3200万公顷，我国棉花可种植面积约为1000万公顷。3.由于棉秆是棉花作物的副产品;印度拥有丰富的木质纤维素生物质资源。摘要本研究的目的是评价碱预处理和酶解棉秆用酵母共培养生产乙醇的潜力Saccharomycescerevisiae和Pachysolentannophilus．
材料与方法
原料收集
棉花(Gossypiumhirsutum本研究使用的NHH44秸秆是从马拉特瓦达地区农民田间收获的材料。
物理预处理
棉秆由不同的不需要的残留物组成，通过粉碎机械去除，然后用实验室搅拌机晒干，脱皮，脱壳和磨成1mm的颗粒大小，并储存在密封的塑料袋中。
成分分析
生物质原料的主要部分是由碳水化合物组成的，碳水化合物本质上是多糖。这些碳水化合物亚基通过HPLC (Zodiac)测定。使用实验室分析程序-002(LAP-002)， NREL(国家可再生能源实验室)的标准方案。4木质素也按照NREL程序测定。
碱预处理和酶水解
按照前人的研究指导进行碱预处理和酶解。5
碱性预处理
碱法预处理:底物添加量为10% (w/v)， NaOH浓度为2%，在121℃下灭菌60分钟oC.预处理后，将生物质从木质化液中分离出来，10000 rpm离心10分钟，每个样品分别收集上清(黑液)，定量检测木质素。脱木质素生物质用蒸馏水反复洗涤，直至pH变为中性，并在60℃的烘箱中干燥oC，并保存以供进一步研究。6
酶水解
预处理生物质的酶解使用从cisco Research Laboratories ppt . Ltd购买的商用纤维素酶进行。孟买,印度。预处理后的棉秆以5%固载量在50mM醋酸缓冲液(pH 4.8)中以100 CMC (Caroxy甲基纤维素)酶为单位孵育，温度为50℃oC转速150转，72小时。孵育后，样品在5000 rpm的冷冻条件下离心10分钟，收集上清作为发酵糖。
棉花秸秆酶解液的发酵
对棉花秸秆解毒水解液进行了发酵酿酒酵母MTCC 36及Pachysolen tannophilusMTCC 1077购自印度昌迪加尔IMTECH微生物型培养集。冻干培养物酿酒酵母和Pachysolen tannophilus分别在酵母和麦芽提取物(YM)培养基上活化。在蒸馏水中加入0.3%酵母膏、0.3%麦芽膏、0.5%蛋白胨和1%葡萄糖配制培养基。将培养基的pH调至6.5。7酵母细胞在30℃时进行有氧生长o在旋转摇床培养箱上以120转/分的速度培养48小时或直到培养物部分覆盖烧瓶底部。完全活化的酵母细胞主动转移到YM琼脂板上，并在30℃下生长o培养48小时，分离菌落在显微镜下检测纯度。
剂制备
接种液为棉秆解毒水解液，添加0.5%酵母膏、1%蛋白胨，pH为5.5%。将离心收获的酵母细胞加入接种液中，在旋转摇床培养箱中以150转/分的转速在30℃下培养oC 24小时8在水解物中促进酵母细胞的健康生长，并用作发酵的接种物。接种量再次设定为发酵总体积的10%。为了定量细胞质量，从每个悬浮液中取1毫升等分进行连续稀释至105将稀释后的培养液100µL分别加入0.3%酵母膏、0.3%麦芽膏、0.5%蛋白胨、1%葡萄糖和2.5%琼脂，铺于YM琼脂板上，30℃孵育o孵育48小时，计数酵母菌落，确保每次接种保持在6.0 × 10左右7cfu/mL对应10g干重/升。
酶法水解棉秆生产乙醇
以棉秆酶解所得滤液为唯一碳源，添加0.1% (w/v)酵母膏、蛋白胨、NH进行发酵4Cl, KH2阿宝40.05% (w/v) MgSO4.7H2O, MnSO4, CaCl2.2H2O, FeCl3..2H2O和ZnSO4在250ml的Erlenmeyer烧瓶中。发酵在半好氧模式下进行(250ml Erlenmeyer烧瓶中含有150ml发酵培养基)，pH为5.5,110灭菌oC等20分钟。9瓶中接种10%的共培养物Saccharomycescerevisiae和Pachysolentannophilus浓度分别为6%和4%。用铝箔密封，在旋转摇床上以120 rpm的转速孵育24小时，然后在30℃的静态模式下保持o温度96小时。每隔12小时一次从每个烧瓶中取出样品，分析乙醇、残糖和细胞生物量浓度。
乙醇、残糖和细胞生长的测定
发酵过程中获得的样品转移到预称重离心管中，在4℃下10000 rpm离心10分钟oC.收集上清液，分析肉汤中乙醇和残糖的浓度，同时用蒸馏水反复洗涤球团，并在60℃的热风烘箱中干燥oC仍然是恒定的重量。10
分析方法
进行研究的分析工具和方法如下。
总还原糖
适当稀释后，用米勒法测定可发酵糖的增溶度。11
气相色谱法测定乙醇含量
每次实验结束后，用0.22µm醋酸纤维素过滤器过滤部分上清，用气相色谱法(Shimadzu Japan)分析。所有分析均按照NREL(国家可再生能源实验室)程序LAP # 011进行，使用ZB-Wax色谱柱(30mm × 0.25mm)和火焰电离检测器。12
统计分析
统计分析采用全随机设计(CRD)，采用印度马哈拉施特拉邦帕尔巴尼马拉特瓦达农业大学(vasantraonaikmarathwada Agriculture University)统计学系开发的MAUSTAT软件。
结果与讨论
棉秆成分分析T
棉秆的主要化学成分是纤维素、半纤维素和木质素，但它们的浓度因生长地点、收获方法和分析程序而异。13棉秆(Gossypiumhirsutum)由42%的聚糖和22%的木聚糖组成，其他半纤维素成分所占比例很小。木质素含量为24.18%。我们的结果与之前报道的结果一致。6、14、15
碱预处理和酶水解
碱法预处理显著地降低了棉秆的木质素，提高了预处理后残留生物质中的糖浓度。从长远来看，纤维素酶可以为生物质的利用提供巨大的好处，因为它可能产生高葡萄糖产量，并有机会应用现代生物技术工具来降低成本。16结果表明，当基质负荷为10% (w/v)时，棉秆粉在121℃下经受2% NaOH的处理o在蒸汽灭菌器中C蒸汽爆炸60分钟，可显著去除0.201 g/g生物质的木质素，当将脱木质素的生物质在50mM醋酸缓冲液(pH 4.8)中以5%固体负荷孵育，并在50℃下暴露100 CMC(羧甲基纤维素)单位酶浓度(每克生物质)进行酶水解时oC转速150转/分，发酵72小时，每克生物质可发酵糖0.49克，对应浓度为24.5 g/L。5最后将得到的棉秆酶解物作为乙醇生产的唯一碳源。
棉花秸秆酶解液共培养发酵酿酒酵母和Pachysolen tannophi逻辑单元
将优化后的碱法预处理和酶解棉秆得到的糖液通过固定的参数进行发酵，分析生物乙醇的生产潜力，并同时使用发酵液中乙醇浓度、底物利用率和细胞质量生长3个分析参数对所有实验装置的结果进行评价。结果的可靠性通过方差分析(ANOVA)进行统计检验。实验在30分进行oC，使用250 mL的Erlenmeyer烧瓶，其中装有150 mL的发酵液(半好氧性质)，其中棉花秸秆水解物作为唯一碳源，糖浓度为24.5 g/L。发酵开始时加入10%的接种量(6%Saccharomycescerevisiae和4%Pachysolentannophilus)，搅拌24小时后静置96小时。样品从06小时开始取出，然后每隔12小时从单独的烧瓶中取出，并进行分析。
统计分析后得到的结果数据见表1。表明，在培养前6小时未检测到乙醇，而糖的消耗和细胞质量浓度分别以18.56%和2.42 g/L的速率开始。至于乙醇生产，从12小时开始，得到0.86 g/L，如图1所示。对应于0.017 g/g原生棉花秸秆、0.27 g/g全息纤维素和0.35 g/g可发酵糖的产量，并在48小时内不断增加，最终在48小时达到最大乙醇产量，产生9.56 g/L，对应于0.191 g/g生物质、0.298 g/g全息纤维素和0.392 g/g可发酵糖的产量。在此基础上，乙醇浓度保持不变，并略有下降，这主要是由于反馈抑制或分解代谢抑制。48小时的发酵效率为76.85%，酵母菌培养物有效消耗了97%以上的水解液糖，如图3所示。同时，细胞质量浓度也增加到孵育36小时(12.14 g/L)，之后未观察到明显变化。此外，在没有酶(对照)的情况下产生的预处理样品的水解液中没有检测到乙醇，因为没有可发酵的糖。有趣的是，在发酵过程中采用共培养，但在生长和生产过程中未观察到二氧生长模式。这一结果与之前报道的结果一致，通过耐温处理，棉花秸秆同时糖化和发酵，乙醇浓度和乙醇产量分别为19.48 g/L和0.21 g/gPichiakudriavzeviiHOP-1。17
结论
综上所述，棉花秸秆酶解液在培养48 h时乙醇产量最高，乙醇浓度为9.56 g/L，生物质产量为0.191 g/g，纤维素产量为0.298 g/g，可发酵糖产量为0.392 g/g。发酵效率和耗糖效率分别为76.85%和97.81%。乙醇的生产受到多种因素的影响，包括底物浓度、共培养环境中的细胞活性以及pH、温度、时间等反应条件，因此本研究可以作为可持续能源发展的一步，需要在工艺优化方面做出更多努力，使工艺更加可行。
参考文献
世界范围内能源需求的增加和化石储量的减少使得替代燃料的开发重新兴起，替代燃料必须是可再生的和环保的。与化石燃料不同，乙醇是通过糖发酵产生的可再生能源。乙醇可以从各种生物质和各种生物质之间生产;木质纤维素生物质资源是一种丰富而经济的资源，可以作为大规模生产乙醇的来源。1木质纤维素生物质资源包括:农业废弃物、工业废弃物、林业废弃物和城市固体废弃物等。2棉花收获后留下的棉花秸秆是木质纤维素农业废弃物的一个例子。全世界棉花可种植面积约为3200万公顷，我国棉花可种植面积约为1000万公顷。3.由于棉秆是棉花作物的副产品;印度拥有丰富的木质纤维素生物质资源。摘要本研究的目的是评价碱预处理和酶解棉秆用酵母共培养生产乙醇的潜力Saccharomycescerevisiae和Pachysolentannophilus．
材料与方法
原料收集
棉花(Gossypiumhirsutum本研究使用的NHH44秸秆是从马拉特瓦达地区农民田间收获的材料。
物理预处理
棉秆由不同的不需要的残留物组成，通过粉碎机械去除，然后用实验室搅拌机晒干，脱皮，脱壳和磨成1mm的颗粒大小，并储存在密封的塑料袋中。
成分分析
生物质原料的主要部分是由碳水化合物组成的，碳水化合物本质上是多糖。这些碳水化合物亚基通过HPLC (Zodiac)测定。使用实验室分析程序-002(LAP-002)， NREL(国家可再生能源实验室)的标准方案。4木质素也按照NREL程序测定。
碱预处理和酶水解
按照前人的研究指导进行碱预处理和酶解。5
碱性预处理
碱法预处理:底物添加量为10% (w/v)， NaOH浓度为2%，在121℃下灭菌60分钟oC.预处理后，将生物质从木质化液中分离出来，10000 rpm离心10分钟，每个样品分别收集上清(黑液)，定量检测木质素。脱木质素生物质用蒸馏水反复洗涤，直至pH变为中性，并在60℃的烘箱中干燥oC，并保存以供进一步研究。6
酶水解
预处理生物质的酶解使用从cisco Research Laboratories ppt . Ltd购买的商用纤维素酶进行。孟买,印度。预处理后的棉秆以5%固载量在50mM醋酸缓冲液(pH 4.8)中以100 CMC (Caroxy甲基纤维素)酶为单位孵育，温度为50℃oC转速150转，72小时。孵育后，样品在5000 rpm的冷冻条件下离心10分钟，收集上清作为发酵糖。
棉花秸秆酶解液的发酵
对棉花秸秆解毒水解液进行了发酵酿酒酵母MTCC 36及Pachysolen tannophilusMTCC 1077购自印度昌迪加尔IMTECH微生物型培养集。冻干培养物酿酒酵母和Pachysolen tannophilus分别在酵母和麦芽提取物(YM)培养基上活化。在蒸馏水中加入0.3%酵母膏、0.3%麦芽膏、0.5%蛋白胨和1%葡萄糖配制培养基。将培养基的pH调至6.5。7酵母细胞在30℃时进行有氧生长o在旋转摇床培养箱上以120转/分的速度培养48小时或直到培养物部分覆盖烧瓶底部。完全活化的酵母细胞主动转移到YM琼脂板上，并在30℃下生长o培养48小时，分离菌落在显微镜下检测纯度。
剂制备
接种液为棉秆解毒水解液，添加0.5%酵母膏、1%蛋白胨，pH为5.5%。将离心收获的酵母细胞加入接种液中，在旋转摇床培养箱中以150转/分的转速在30℃下培养oC 24小时8在水解物中促进酵母细胞的健康生长，并用作发酵的接种物。接种量再次设定为发酵总体积的10%。为了定量细胞质量，从每个悬浮液中取1毫升等分进行连续稀释至105将稀释后的培养液100µL分别加入0.3%酵母膏、0.3%麦芽膏、0.5%蛋白胨、1%葡萄糖和2.5%琼脂，铺于YM琼脂板上，30℃孵育o孵育48小时，计数酵母菌落，确保每次接种保持在6.0 × 10左右7cfu/mL对应10g干重/升。
酶法水解棉秆生产乙醇
以棉秆酶解所得滤液为唯一碳源，添加0.1% (w/v)酵母膏、蛋白胨、NH进行发酵4Cl, KH2阿宝40.05% (w/v) MgSO4.7H2O, MnSO4, CaCl2.2H2O, FeCl3..2H2O和ZnSO4在250ml的Erlenmeyer烧瓶中。发酵在半好氧模式下进行(250ml Erlenmeyer烧瓶中含有150ml发酵培养基)，pH为5.5,110灭菌oC等20分钟。9瓶中接种10%的共培养物Saccharomycescerevisiae和Pachysolentannophilus浓度分别为6%和4%。用铝箔密封，在旋转摇床上以120 rpm的转速孵育24小时，然后在30℃的静态模式下保持o温度96小时。每隔12小时一次从每个烧瓶中取出样品，分析乙醇、残糖和细胞生物量浓度。
乙醇、残糖和细胞生长的测定
发酵过程中获得的样品转移到预称重离心管中，在4℃下10000 rpm离心10分钟oC.收集上清液，分析肉汤中乙醇和残糖的浓度，同时用蒸馏水反复洗涤球团，并在60℃的热风烘箱中干燥oC仍然是恒定的重量。10
分析方法
进行研究的分析工具和方法如下。
总还原糖
适当稀释后，用米勒法测定可发酵糖的增溶度。11
气相色谱法测定乙醇含量
每次实验结束后，用0.22µm醋酸纤维素过滤器过滤部分上清，用气相色谱法(Shimadzu Japan)分析。所有分析均按照NREL(国家可再生能源实验室)程序LAP # 011进行，使用ZB-Wax色谱柱(30mm × 0.25mm)和火焰电离检测器。12
统计分析
统计分析采用全随机设计(CRD)，采用印度马哈拉施特拉邦帕尔巴尼马拉特瓦达农业大学(vasantraonaikmarathwada Agriculture University)统计学系开发的MAUSTAT软件。
结果与讨论
棉秆成分分析T
棉秆的主要化学成分是纤维素、半纤维素和木质素，但它们的浓度因生长地点、收获方法和分析程序而异。13棉秆(Gossypiumhirsutum)由42%的聚糖和22%的木聚糖组成，其他半纤维素成分所占比例很小。木质素含量为24.18%。我们的结果与之前报道的结果一致。6、14、15
碱预处理和酶水解
碱法预处理显著地降低了棉秆的木质素，提高了预处理后残留生物质中的糖浓度。从长远来看，纤维素酶可以为生物质的利用提供巨大的好处，因为它可能产生高葡萄糖产量，并有机会应用现代生物技术工具来降低成本。16结果表明，当基质负荷为10% (w/v)时，棉秆粉在121℃下经受2% NaOH的处理o在蒸汽灭菌器中C蒸汽爆炸60分钟，可显著去除0.201 g/g生物质的木质素，当将脱木质素的生物质在50mM醋酸缓冲液(pH 4.8)中以5%固体负荷孵育，并在50℃下暴露100 CMC(羧甲基纤维素)单位酶浓度(每克生物质)进行酶水解时oC转速150转/分，发酵72小时，每克生物质可发酵糖0.49克，对应浓度为24.5 g/L。5最后将得到的棉秆酶解物作为乙醇生产的唯一碳源。
棉花秸秆酶解液共培养发酵酿酒酵母和Pachysolen tannophi逻辑单元
将优化后的碱法预处理和酶解棉秆得到的糖液通过固定的参数进行发酵，分析生物乙醇的生产潜力，并同时使用发酵液中乙醇浓度、底物利用率和细胞质量生长3个分析参数对所有实验装置的结果进行评价。结果的可靠性通过方差分析(ANOVA)进行统计检验。实验在30分进行oC，使用250 mL的Erlenmeyer烧瓶，其中装有150 mL的发酵液(半好氧性质)，其中棉花秸秆水解物作为唯一碳源，糖浓度为24.5 g/L。发酵开始时加入10%的接种量(6%Saccharomycescerevisiae和4%Pachysolentannophilus)，搅拌24小时后静置96小时。样品从06小时开始取出，然后每隔12小时从单独的烧瓶中取出，并进行分析。
统计分析后得到的结果数据见表1。表明，在培养前6小时未检测到乙醇，而糖的消耗和细胞质量浓度分别以18.56%和2.42 g/L的速率开始。至于乙醇生产，从12小时开始，得到0.86 g/L，如图1所示。对应于0.017 g/g原生棉花秸秆、0.27 g/g全息纤维素和0.35 g/g可发酵糖的产量，并在48小时内不断增加，最终在48小时达到最大乙醇产量，产生9.56 g/L，对应于0.191 g/g生物质、0.298 g/g全息纤维素和0.392 g/g可发酵糖的产量。在此基础上，乙醇浓度保持不变，并略有下降，这主要是由于反馈抑制或分解代谢抑制。48小时的发酵效率为76.85%，酵母菌培养物有效消耗了97%以上的水解液糖，如图3所示。同时，细胞质量浓度也增加到孵育36小时(12.14 g/L)，之后未观察到明显变化。此外，在没有酶(对照)的情况下产生的预处理样品的水解液中没有检测到乙醇，因为没有可发酵的糖。有趣的是，在发酵过程中采用共培养，但在生长和生产过程中未观察到二氧生长模式。这一结果与之前报道的结果一致，通过耐温处理，棉花秸秆同时糖化和发酵，乙醇浓度和乙醇产量分别为19.48 g/L和0.21 g/gPichiakudriavzeviiHOP-1。17
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图1:时间对酵解棉秆共培养乙醇发酵的影响酿酒酵母和Pachysolen tannophilus 点击这里查看图 |
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图2:时间对乙醇产率的影响 乙醇发酵由酶水解而成 共栽棉秆酿酒 酵母和Pachysolen tannophilus 点击这里查看图 |
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图3:时间对发酵的影响 乙醇过程中糖的消耗效率 酶法水解棉花发酵 共培养茎酿酒酵母 和Pachysolen tannophilus 点击这里查看图 |
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表1:酶法生产乙醇 用共培养法水解棉秆 酿酒酵母和Pachysolentannophilus 点击这里查看表格 |
结论
综上所述，棉花秸秆酶解液在培养48 h时乙醇产量最高，乙醇浓度为9.56 g/L，生物质产量为0.191 g/g，纤维素产量为0.298 g/g，可发酵糖产量为0.392 g/g。发酵效率和耗糖效率分别为76.85%和97.81%。乙醇的生产受到多种因素的影响，包括底物浓度、共培养环境中的细胞活性以及pH、温度、时间等反应条件，因此本研究可以作为可持续能源发展的一步，需要在工艺优化方面做出更多努力，使工艺更加可行。
参考文献
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