当前世界环境

介绍

黄金开采利用汞会产生含汞废物，造成环境污染。汞属于重金属，对生物有毒。汞可以攻击中枢神经系统，导致记忆丧失、颤抖和运动能力下降。中毒导致胎儿的破坏已被发现。日本的Minimata病就是汞中毒的例子。^1、2

汞作为一种环境污染物，需要引起人们的重视和解决问题。汞的解毒可以通过沉淀法、混凝法、反渗透法、离子交换法和活性炭吸附法等化学方法进行。^3、4然而，这一过程相对昂贵，并可能引起新的问题，即这些化合物在沉积物和水生生物中的积累。⁴

汞解毒可以通过使用抗汞细菌来完成，这种细菌具有抗汞基因，称为mer操纵子^，．^4、5印度尼西亚马鲁古省Waeapo街道的Waekerta村有金矿，在那里使用汞和废物进行黄金加工，被排放到环境中，而不考虑污染发生(图1)。基于这一背景，有必要从黄金加工的沉积物中分离出抗汞细菌，这些细菌能够在含有500 ppm HgCl的NA培养基上生长₂并分析了HgCl的还原能力₂．

材料与方法

研究材料

本研究使用了马鲁古Waekerta村黄金加工废物处理场的沉积物样本。本研究使用的材料为营养琼脂(Merck)、营养肉汤(Merck)和盐酸₂．

研究工具

本研究使用的仪器有热板、高压灭菌器、涡流、培养箱、Microgen TM GnA + B-ID系统、显微镜、分光光度计、CV-AAS、层流气流柜等。

抽样

样本取自韦克尔塔村42个黄金加工地点的20%，因此⁹选取沉积物取样地点。从5个不同地点的每个地点采集的样本然后混合成一个。选取矿区的土地样本作为比较，使样本总数变为10个。韦克尔村采样点位置如图2所示。

细菌隔离

采用涂布平板法分离抗汞菌。⁶对沉积物和土壤样品进行一系列稀释(10¹, 10²和10³)，加入生理盐水(0.85% NaCl)。从10开始³取0.1 ml稀释液，铺在含有含有10ppm HgCl的选择性培养基即营养琼脂(NA)的培养皿上₂．然后在室温下培养3天。将具有不同菌落形态特征的细菌分离株重新分离到新的培养基中，以获得纯培养物，并储存在琼脂斜面中以供进一步测试。

汞抗性细菌选择

细菌选择的依据是分离菌在不同盐酸培养基中的生长能力₂浓度。分离菌在含25ppm HgCl的NA培养基上用条纹法成虫₂在室温下培养24小时。如果分离物能生长，则在添加盐酸的培养基上用划线法重新培养分离的干酪菌₂以较高的浓度50ppm、100ppm、250ppm、400ppm、500ppmin为序得到较优的分离菌，它们都能在较高的HgCl环境中生存₂浓度。纯化的分离株保存在营养琼脂倾斜培养基中，温度为-20℃。

抗汞细菌鉴定

鉴定耐汞菌的参数包括NA培养基上的菌落形态、革兰氏染色和生理特性(生化试验)。使用Microgen™kitGNA+B-ID System Identification (Microgen Bioproduct, UK)检测生理特性。

抗汞细菌生长最佳温度的测定

为确定最佳生长温度，分离菌在营养肉汤培养基上生长，培养温度为:25℃、30℃、37℃和45℃。培养物在此温度下培养24小时。用分光光度计在620nm波长处测定菌株的浊度。在620nm波长处可观察到细菌细胞的吸光度值，每次处理重复3次。

测定抗汞细菌生长的最佳pH值

为了确定最佳生长pH，分离菌分别在pH为5、6、7、8和9的营养肉汤中生长。在最佳温度下培养24小时。采用分光光度计在620 nm波长下测定菌株的生长情况，每处理3次。

细菌生长曲线的测定

在培养24小时后，在含有10ppm HgCl的NA培养基上，无菌地将一组优等细菌分离株恢复原状₂)接种于100ml NB培养基中，在erlenmeyer烧瓶中，在室温下的旋转摇床(100rpm)上孵育。用生理盐水洗涤24小时培养，取5ml培养物接种于浓度为10pp mHgCl2的NB培养基45 ml中，室温下在摇床(100转/分)上孵育。在620nm波长处测定悬浮培养吸光度值。吸光度测量从0小时到72小时开始，间隔4小时。然后将所得吸光度数据转换成生长曲线。x轴是时间，y轴是吸光度。将生长曲线与细菌在不含HgCl的NB培养基中的生长曲线进行比较₂．

降汞细菌活性试验

在此阶段，将分离的细菌置于NB培养基中，在250 ml erlenmeyer中培养24小时，然后用生理盐水洗涤分离的细胞，用分光光度计在波长620 nm处测量吸光度。取吸光度值为2的培养物0.1 ml，在含100 ppm HgCl浓度的NB培养基中生长₂，然后在顶部摇床(100 rpm)上孵育7天。然后，用0.2µm大小的膜过滤器从培养基中分离细菌细胞。采用冷蒸汽铌原子吸收分光光度计(CV - AAS)测定介质中汞的浓度。此外，NB培养基中含有100ppm的HgCl₂以未接种抗汞菌为阳性对照，以不含HgCl的NB培养基为阳性对照₂以耐汞菌为阴性对照。CV-AAS的工作原理是将二氧化汞化合物转化为汞离子，汞离子随后还原为金属汞，并在波长253.7 nm处分析其冷蒸汽原子吸收。所用试剂为SnCl2还原剂，H2SO4 + HCl酸溶液(Rondonuwu, 2011)。为了确定除汞效率的水平，使用了这个公式



C1 =初浓度(ppm);C2 =终浓度(ppm);效率

数据分析

对数据进行定性和定量分析。定性是通过描述表征和鉴定抗汞细菌分离株的结果来减少汞。定量上，通过吸光度测定细菌细胞数，进行pH试验和生长曲线测定。所得数据采用柱状图的形式，生长曲线采用折线图的形式，使用Microsoft Excel程序进行绘制。

结果与讨论

两株抗汞细菌能够在含有500 ppm HgCl的NA培养基中存活₂是在处理沉积物样本中发现的。分离株为L.10bandL.10c。经鉴定，这些分离株为芽孢杆菌去哪里Aeromonashydrophyla．分离物的宏观和微观形态见图3和图4，各分离物的特性见表1。

芽孢杆菌sp在日本和印度被发现是一种抗汞细菌。⁷此外,芽孢杆菌sp也在印度尼西亚通达诺河被发现。⁸蜡样芽胞杆菌和Bacillussubtilis在泗水Kalimas河中发现的也对汞有抵抗力。⁹芽孢杆菌Spis更常被发现是抗汞细菌Aeromonashydrophila．Aeromonashydrophyla在被西爪哇的hgin万隆污染的金矿沉积物中发现可以在550毫克/LHgCl下生长_2.¹⁰此外，一些菌株A.hydrophila在突尼斯被重金属污染的海水、鱼类和废水中发现。¹¹温度是影响细菌生长的环境因素之一。芽孢杆菌sp.在25ËšC温度下吸光度值最高(0.216)，在45ËšC温度下吸光度值最低(0.118)。气单胞菌属hydropila在37ËšC处吸光度值最高(0.404)，在45ËšC处吸光度值最低(0.224)(图5)。温度对细菌生长的影响是由于温度影响代谢过程中酶的活性。温度影响着化学反应过程中细菌的生长、生长速度，以及微生物的生长总量。¹²虽然吸光度值不同的细菌都分类为中温细菌。嗜中温细菌是一组可以在20-45ËšC温度下生长的细菌。¹³

细菌的生长会受到各种环境因素的影响，其中之一就是培养基的pH值。培养基的酸度影响其生长芽孢杆菌sp和水螅门．芽孢杆菌sp在pH为6时生长最佳，吸光度值为0.106，吸光度值随培养基pH的增加而降低(图6)。

与…相反芽孢杆菌sp,答:hydrophilapH值为7时吸光度值最高(0.192)，pH值为5时吸光度值最低(0.11)(图6)。酸度的高低影响细菌的生长，因为pH值影响细菌代谢中的酶。如果pH值不合适，酶的活性就会降低，这是因为酶在适当的电离状态下才会有活性。不同酶的适宜电离条件也不同，但一般在pH 6-8之间。¹⁴由于pH值的变化，酶可以变性。酶在中性pH下起作用，当环境变得非常酸性或非常碱性时，酶就会失去活性。¹⁵根据pH值范围内的生长能力，芽孢杆菌sp,答:hydrophila可分为中性粒细胞细菌。中性粒细胞是一种能在pH 6-8下生长的细菌群。^14、15的成长芽孢杆菌sp和气单胞菌属hydrophila在含有10ppm盐酸的NB培养基中₂而孵育3天还未达到固定阶段。所得结果与对照组不同芽孢杆菌Sp，在第37和答:hydrophila在第44小时到达固定阶段，68小时到达死亡阶段(图7)。在含10ppm HgCl₂这两种细菌都只能达到指数阶段。芽孢杆菌Sp在68和达到指数相位答:hydrophila(图7)。这是因为适应阶段足够长。这是由于HgCl₂在中。在适应阶段，新酶的合成发生，根据培养基和细胞数量的增加而没有发现。¹⁴在含HgCl的培养基中适应期的长度₂发生在细菌中Ochrobactrumsp S79和L6T2分离株，其中这些细菌的第二固定期发生在孵育时间的第4天至第9天。¹⁶

Aeromonash ydrophila和芽孢杆菌可将100 PPM的汞含量降低到1.67ppmA.hydro费拉1.33ppm芽孢杆菌S型孵育7天。测定培养基中汞含量的结果，用于测定两种细菌的除汞效率。芽孢杆菌能够减少98.7%的汞含量，其中as水仙为98.33%(表2)芽孢杆菌去哪里A.hydrophila降低与抗汞特性相关的汞含量。细菌对汞的抵抗力是由于mer操纵子包含在质粒中。^4、5

Mer操纵子由各种各样的mergenes组成。每一种细菌都有自己的基因变异mer操纵子。^3.但细菌对无机汞的耐药机制在不同菌种中几乎相同。这是由于汞中汞的减少^{2 +}对Hg⁰由汞离子诱导还原酶编码mer操纵子基因MerA。²汞离子还原酶与汞成键^{2 +}还原发生在电子通过flv in键从NADPH in转移到NADP，因此形成了还原性汞，即ieHg⁰．⁵汞的减少^{2 +}对Hg⁰是用来除去氧化汞和减少溶解在介质中的汞。¹⁷已知芽孢杆菌属的一些细菌具有基因变异meroperon．Bacillusmegaterium和Bacillusmacroides是外谱抗汞细菌，在哪里蜡样芽胞杆菌和Bacilluslicheniformis是一种箭型抗汞细菌。¹⁸只有汞还原蛋白(MerA)的细菌被称为窄谱抗汞细菌，而广谱抗汞细菌是含有汞还原蛋白(MerA)和蛋白质器官聚合酶(MerB)的细菌。MerB的作用是催化汞-碳键的终止，产生以盐硫醇形式存在的有机化合物。^20.芽孢杆菌年代pand答:hydrophila在这项研究中发现的光谱范围尚不清楚，这是在减少汞。到目前为止还没有关于mergene所有的变量气单胞菌属hydrophila．然而，其他种类的气单胞菌属是已知的变种mer操纵子基因。Aeromonassalmonicida他有一些海洋博物馆基因mer操纵子即MerR A, merp, MerR, MerE, MerT, MerD和MerB。¹⁹嗜水气单胞菌是能够改变细胞的形状，从杆状变成汞暴露后的圆形。¹¹

确认

作者对印度尼西亚巴厘岛乌达亚纳大学生物科学系主任对本研究的支持表示感谢。同时感谢印尼马鲁古省省长对本研究工作的支持。

参考文献