当前世界环境

介绍

假单胞菌是革兰氏阴性，非孢子形成，杆状细菌的一个属。它们通常存在于土壤、水和腐烂物质中，包括一些植物和动物病原体。铜绿假单胞菌是双重考核的典型例子;在临床环境中，它是最重要的机会致病菌之一，是大多数医院感染的原因。¹然而，在环境保护领域，这种生物对人类健康的关注尚未得到承认，该物种的菌株通常用于生物修复目的。假单胞菌作为一种生物防治剂，铁载体已经得到了有效的应用，市场上的一些商业产品已经显示出其功效，然而，纯化的铁载体作为抑菌剂或抑菌剂与其他抗菌因子的结合必将引起人们的极大兴趣。假单胞菌sp .产生许多化合物，这些化合物负责控制疾病，也有助于植物的生长。这些抑制性化合物是铁载体、HCN、降解胞外酶，如几丁质酶、蛋白酶、纤维素、β-1,3葡聚糖酶和抗生素，如硝基吡啶、卟啉和非那嗪。^2、3、4

材料与方法

土壤样品的采集与选择性分离假单胞菌spp。

首先从印度喜马偕尔邦蓬塔萨希布的七个不同地点随机收集土壤样本。从车库、焊接车间、加油站和其他污染场所进行了采样。样品在贴上适当的标签后装入灭菌的聚乙烯袋中，并立即购买到实验室。土壤电镀在72小时内完成。样品收集。选择性分离假单胞菌采用假单胞菌分离琼脂(Pseudomonas Isolation Agar, PIA)培养基，37℃培养^ºC 24小时。经过反复传代培养，最终获得纯培养物，并进行耐镉试验。

分离细菌的特性

纯文化假单胞菌通过形态和生化特征鉴定了耐镉品种^5、6最后通过16S rDNA测序证实。

16S rDNA测序鉴定

纯培养物生长到log期，从细菌分离物中提取基因组DNA。⁷采用正向引物和反向引物分别扩增16S rRNA基因。16S rRNA基因的~1.4 kb pcr产物用于DNA测序。测序后，利用BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和Ribosomal Database Project (http://rdp.cme.msu.edu/)对序列进行分析，寻找最接近的同源序列。根据最大同源分数选择前10个同源序列。对序列进行比对，构建距离矩阵，然后采用neighbor - joining法构建系统发育树。

镉耐受性筛选

所有分离株均进行了金属耐受性检查。测定其对镉(CdCl)的最小抑制浓度(MIC)₂)，通过逐渐增加营养琼脂(NA)板上镉的浓度，直到菌株不能在板上形成菌落。初始浓度为50μg/ml，最后浓度培养的细胞在平板上划条转移到较高浓度。当分离株不能在平板上生长时，记录MIC。测定了对铜、铅、锌的最低抑菌浓度。

回收菌株的抗生素敏感性和耐药模式

采用Kirby-Bauer圆盘扩散法对分离菌株进行抗生素敏感性试验⁸抗生素盘购自“HIMEDIA”。本研究使用的抗生素有阿米卡星、阿莫西林、氨苄西林、头孢氨苄、头孢克肟、头孢曲松、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、甲氧西林、氧氟沙星和四环素。测定抑菌带直径以mm为单位，按照标准抗生素片敏试验方法将菌株分为耐药(R)、中间(I)和敏感(S)。

盆栽试验 细菌接种物的制备

铜绿假单胞菌考虑了耐镉程度较高的SN4，制备细菌接种物。分离菌接种于营养液中，28±2°C，摇床培养箱内，120 rpm，保存48小时。孵育结束后，将5 ml肉汤加入45 ml蒸馏水中配制生物肥料并进行盆栽试验。

水稻幼苗采收及播前处理

的种子栽培稻在阿萨姆邦马辛普尔的KrishiVikas Kendra收集。种子的大小和重量是均匀的。将干净的种子浸入水中;丢弃漂浮的种子，选择沉降在容器底部的种子。用95%酒精对种子表面消毒30秒，然后用0.1% (w/v) HgCl消毒₂静置1-2分钟后用无菌蒸馏水冲洗5-6次。⁹然后将种子放入含有Hogland溶液的无菌培养皿中并保存过夜。

锅试验研究

土盆(24厘米× 12厘米× 12厘米)灌满消毒过的沙质壤土。种子被撒在所有的花盆里，以研究它们的作用铜绿假单胞菌sn4对芽部生长的影响选用 漂白亚麻纤维卷在含镉土壤中播种(20毫克/公斤和50毫克/公斤土壤)。在镉污染土壤中添加生物肥料配方，进行盆栽试验。连续3周，每天记录幼苗的发芽情况和生长规律。

统计分析

盆栽试验完成后，采用SPSS 16.0软件对统计数据进行分析。描述性统计计算具有标准误差和偏差的所有重复的平均值。进行了多次比较试验，以评估每种细菌分离株的有效性。方差分析(ANOVA)显示显著效应时，图key -b检验(假设方差相等)和G一个采用mes-Howell检验(假设方差不等)进行组间比较，P<0.05和P<0.01。

结果 所选分离株的特性

一共有32个假单胞菌属分离自印度喜马偕尔邦的ponta Sahib。总活菌数从32 X 10不等⁴(CFU/g)至43 × 10⁴(CFU / g)。所有分离株均为革兰氏阴性棒。大多数分离株吲哚阴性、MR阴性、VP阴性和脲酶阴性。氧化酶测试假单胞菌分离株阳性，提示为需氧菌株。观察到柠檬酸盐测试阳性结果，推断这些生物利用柠檬酸盐作为碳和能量的唯一来源的能力。分离物还能够产生一种酶“硝酸盐还原酶”，导致硝酸盐(NO)的还原_3.）.选择对镉耐受性最高且盆栽试验效果显著的菌株进行16S rDNA测序。利用Ps-11序列(1393 bp)和数据库中的代表性序列，构建了邻联树。结果表明，菌株编码Ps-11与种属的序列相似性最大铜绿假单胞菌并占据相同的系统发育分支(图1)铜绿假单胞菌SN4并提交给NCBI-GenBank。由此得到的加入号是KF44770。

图1:基于邻域连接法构建的部分16S rDNA序列，所研究样本(Ps-11)与代表性物种的系统发育关系。所研究的样品(Ps-11)已提交至NCBI-Genbank，获得的入库号为KF44770 (铜绿假单胞菌应变SN4)。 点击这里查看图

最小抑菌浓度(MIC)

所有菌株均表现出对镉的抗性，最小抑菌浓度(MIC)在300 ~ 1800μg/ml之间。分离菌株对氯化镉的耐受能力差异很大。约53%的测试分离株耐受1000μg/ml CdCl₂浓度。铜绿假单胞菌SN4(分离物代码:Ps-11)对镉的MIC值为1800μg/ml。多金属公差试验表明，其MIC值为铜绿假单胞菌铅的SN4为170μg/ml，铜为60μg/ml，锌为1800μg/ml(表1)。

表1:所有分离菌株的最小抑菌浓度

隔离代码	最小抑制浓度
	镉	引领	铜	锌
Ps-1	1400µg / ml	150µg / ml	50µg / ml	1800µg / ml
Ps-2	1100µg / ml	80µg / ml	60µg / ml	1500µg / ml
台	800µg / ml	100µg / ml	40µg / ml	1600µg / ml
Ps-4	700µg / ml	110µg / ml	30µg / ml	1100µg / ml
Ps-5	1000µg / ml	150µg / ml	40µg / ml	1600µg / ml
Ps-6	1200µg / ml	160µg / ml	50µg / ml	1700µg / ml
Ps-7	700µg / ml	120µg / ml	50µg / ml	1200µg / ml
Ps-8	400µg / ml	100µg / ml	30µg / ml	1000µg / ml
Ps-9	1100µg / ml	140µg / ml	20µg / ml	1200µg / ml
Ps-10	1000µg / ml	150µg / ml	50µg / ml	1300µg / ml
Ps-11	1800µg / ml	170µg / ml	60µg / ml	1800µg / ml
Ps-12	600µg / ml	100µg / ml	60µg / ml	1000µg / ml
Ps-13	1700µg / ml	160µg / ml	60µg / ml	1600µg / ml
Ps-17	1400µg / ml	170µg / ml	60µg / ml	1800µg / ml
Ps-15	300µg / ml	100µg / ml	30µg / ml	1000µg / ml
第16	500µg / ml	120µg / ml	20µg / ml	900µg / ml
Ps-17	1200µg / ml	170µg / ml	60µg / ml	1300µg / ml
Ps-18	800µg / ml	140µg / ml	50µg / ml	1000µg / ml
Ps-19	800µg / ml	150µg / ml	40µg / ml	1300µg / ml
ps 20	600µg / ml	120µg / ml	30µg / ml	900µg / ml
Ps-21	1200µg / ml	150µg / ml	60µg / ml	1400µg / ml
Ps-22	600µg / ml	120µg / ml	50µg / ml	1300µg / ml
Ps-23	400µg / ml	120µg / ml	40µg / ml	1300µg / ml
Ps-24	400µg / ml	120µg / ml	40µg / ml	1000µg / ml
Ps-25	1500µg / ml	130µg / ml	40µg / ml	1200µg / ml
Ps-26	1200µg / ml	120µg / ml	50µg / ml	900µg / ml
Ps-27	1800µg / ml	170µg / ml	60µg / ml	1800µg / ml
Ps-28	1000µg / ml	130µg / ml	40µg / ml	1500µg / ml
Ps-29	1200µg / ml	120µg / ml	30µg / ml	1200µg / ml
Ps-30	600µg / ml	120µg / ml	30µg / ml	900µg / ml
Ps-31	300µg / ml	100µg / ml	30µg / ml	1000µg / ml
Ps-32	1000µg / ml	130µg / ml	40µg / ml	1500µg / ml

抗生素敏感性和耐药模式铜绿假单胞菌SN4

大部分的假单胞菌本研究分离的菌株对一组抗生素表现出高耐药模式。有人观察到铜绿假单胞菌SN4对阿莫西林、氨苄西林、头孢氨苄、头孢克肟、卡那霉素、甲氧西林和四环素耐药。其他研究人员也证实了这一事实，即多重金属耐药细菌分离株对一组抗生素表现出高度耐药性。¹⁰

的影响铜绿假单胞菌SN4的生长栽培稻在含镉土壤中接种

接种P．绿脓杆菌sn4显著提高了玉米幼苗的萌发和生长栽培稻与对照集比较。幼苗萌发20天后，多重对比结果显示铜绿假单胞菌在土壤镉浓度为50mg/kg时，SN4的幼苗生长比未接种的对照盆栽提高了12%(表2)。然而，在土壤镉浓度为20mg/kg时，幼苗发芽率略有提高(平均差值= 0.96±0.63 cm)，无统计学意义。结果表明镉的生物吸收量最大铜绿假单胞菌sn4土壤中镉含量升高。

表2:幼苗生长情况栽培稻接种抗镉剂 铜绿假单胞菌 含镉土壤中的SN4

实验装置	拍摄长度(厘米)
	镉含量为20mg/kg土壤	镉含量为50mg/kg土壤
控件(没有Cd和)铜绿假单胞菌SN4)	31.66±0.42	31.66±0.42
未接种对照(仅含乳糜泻)	27.62±0.35	25.18±0.26
铜绿假单胞菌SN4 + Cd	28.58±0.98ns	28.18±0.49*

数值为5个重复的平均值±标准差;Ns =无显著性;*= P<0.01;与未接种对照比较。

讨论

随着人们对镉对环境，特别是植被的影响的日益关注，人们对镉的生物修复策略越来越感兴趣。显微镜下的证据显示分离的细菌为革兰氏阴性，杆状。此外，生化测试和16S - r DNA证实分离物为铜绿假单胞菌．与未加金属修饰的对照相比，在任何给定时间间隔内增加培养板上镉的浓度，细菌菌落的生长(cfu/g)都有所下降。金属浓度越高，微生物负荷量越低，这与安炎乌的研究有关et al。 ¹¹．本研究证实了假单胞菌隔离。根据分离菌株的MIC值和抗生素谱图，并由Bruins研究et al ., ¹²，假单胞菌Sp.对多种有毒物质、重金属和抗生素具有耐药性。铜绿假单胞菌SN4对镉的耐受性可达1800μg/ml，并表现出多金属耐受性。重金属的毒性水平影响内膜和细胞器的结构和通透性，导致酶活性抑制，营养失衡，光合作用和蒸腾速率降低^13、14，刺激自由基和活性氧的形成，导致氧化应激¹⁵抑制种子萌发和幼苗生长、生殖发育、种子产量和种子品质¹⁶并在作物植物中引起有害的解剖和超结构变化^17、18在目前的研究中，应用铜绿假单胞菌施镉量为20和50mg/kg时，SN4幼苗的生长和发芽率均有显著提高。在镉掺入土壤中接种20 d后施用铜绿假单胞菌据观察，与未接种的对照盆相比，水稻植株的幼苗生长显著。一些研究已经证明，抗镉和促进植物生长的细菌可以保护植物免受金属的毒性影响^{19日,20日,21日}．整体实验表明铜绿假单胞菌SN4 (Genbank Acc)编号:KF44770)可促进生长栽培稻在受镉污染的农田中(图2)，从而专用于长期农业用途的场地。这方面的知识还需要进一步的研究来拓展铜绿假单胞菌在用作商业用途之前。

图2:的效果铜绿假单胞菌SN4对玉米幼苗生长的影响栽培稻在土壤中接种50 mg/kg镉，并与对照组进行比较(在第一个对照锅中不添加镉和细菌接种，使幼苗生长正常。在第二盆栽中，土壤中镉的添加浓度为50 mg/kg;证明镉对幼苗萌发和生长的毒性作用。在最后的试锅中，加入铜绿假单胞菌SN4菌株获得了显著的幼苗生长，如表2所示。 点击这里查看图

结论

本研究从印度喜马偕尔邦Ponta Sahib污染地点分离出32株耐镉细菌。大多数分离株表现出多金属耐受性，并对一组抗生素耐药。铜绿假单胞菌SN4对镉的耐受性最高，可考虑进行盆栽试验研究。与对照处理相比，接种铜绿假单胞菌土壤镉浓度为50mg/kg时sn4对幼苗萌发的影响。结果表明，微生物接种改变了土壤中金属的生物有效性，接种20天后，幼苗生长速度提高了12%。从本研究中可以看出，应用特别适应高浓度重金属的HMRB将提高重金属污染土壤的修复能力。生物吸收潜力的评价仍需进一步研究铜绿假单胞菌SN4的田间试验及其作用机制。

致谢

作者希望感谢新德里印度政府生物技术部在印度Silchar的Gurucharan学院建立了机构级生物技术中心和生物信息学中心。作者还感谢印度喜马偕尔生命科学研究所，Ponta Sahib, hp，在本研究的初始阶段提供帮助。

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