当前世界环境

介绍

在一个科学发现和技术进步使生活水平提高而眼花缭乱的世界里，这种发展的消极后果开始显现并成为焦点。微生物在环境条件下，通过多种酶介导的反应进行快速和显著的特异性代谢过程。酶替代苛刻的化学技术导致了对天然微生物生物多样性的深入探索，以发现能够有效发挥作用的酶，并在不久的将来产生无污染的“梦想技术”。斯里尼瓦桑(et al .,1999)。

我们生活在“细菌时代”(古尔德，1996)的“微生物星球”(沃斯，1999)上。微生物，最早的细胞生命形式，在多细胞、宏观生命形式发展之前，已经在地球上活跃了30多亿年。在这段时间里，一直延续到现在，通过一系列惊人的不同代谢和生理能力的发明，微生物进化到能够利用非生物世界呈现的众多环境和微栖息地。迅速积累的证据表明，微生物很可能是地球上绝大多数生物的来源。微生物进行着令人震惊的多种代谢活动，其中一些在为其他生命形式的进化创造条件方面发挥了重要作用。

迄今为止，估计有170万种已被描述;目前地球上存在的物种总数估计从500万到近1亿不等。真菌是世界上仅次于昆虫的第二大生物群。目前已知的真菌种类约为72,036种，在印度发现了27,000种真菌(Manoharachary, 2002)。

印度记录的真菌数量超过27,000种，是昆虫之后记录的最大的生物群落出版社。, 1996)。真核真菌属真核生物界，有4门103目484科4979属。真菌是真核生物中的一员，真核生物包括酵母菌和霉菌等微生物，以及我们更熟悉的蘑菇。真菌在有机物分解中起着重要作用，在养分循环和交换中起着重要作用。长期以来，它们一直被用作食物的直接来源，如蘑菇和松露，作为面包的膨松剂，以及用于发酵各种食品，如葡萄酒、啤酒和酱油。自20世纪40年代以来，真菌已被用于生产抗生素，最近，真菌产生的各种酶被用于工业和洗涤剂。真菌也被用作生物制剂来控制杂草和害虫。许多物种产生被称为真菌毒素的生物活性化合物，如生物碱和聚酮，它们对包括人类在内的动物有毒。它们的生长可能与它们在28°C下生长并产生蛋白质和脂肪水解酶的能力有关。土壤真菌的识别主要有两种方法;用培养方法直接检查和分离。 The limitations of the first method are obvious, and although it has produced many excellent results, the physical barriers in the way of such a method limit its usefulness, and in most cases such observations as were made by it were confirmed by resort to cultural methods. In the second method, that of isolation of cultures, has been more widely used and has produced the greater numbers of species of recognized soil fungi. The substrate used in making the isolation is of prime importance in determining the species that will be taken cannot be denied. The remarkable discovery of Coker and his associates that many species of saprolegniales are seemingly present in a very wide range of soils and localities was the result of the application of the techniques and materials used to isolate this group of fungi from water samples.

图1 点击此处查看图

生物多样性是指地球上生命的可变性，包括所有现存的动物、植物和微生物物种。根据Hawksworth(2002)，真菌是生物多样性的主要组成部分，对其他生物的生存至关重要，在全球生态过程中至关重要。真菌是无所不在的生物，存在于所有类型的栖息地，是适应性最强的生物。土壤是细菌、真菌、酵母菌、线虫等微生物最重要的栖息地之一。丝状真菌是土壤生物量的主要贡献者(Alexander 1977)。它们构成了负责分解有机化合物的有机营养生物的主要群体。它们的活性参与了土壤中有毒物质的生物退化和生物降解(Rangaswami)et al .,1999)。人们已经发现，土壤中存在的真菌属和种的数量比任何其他环境中都要多(Nagmani)et al .,2005)。真菌参与生态系统的养分循环和维持，在土壤形成、土壤肥力、土壤结构和土壤改良中发挥重要作用(Hao-quinet al .,2008)。真菌在生态系统的结构和功能中占有非常重要的地位。它们分解腐殖质中的有机物，释放养分，吸收土壤碳，固定有机养分。对土壤微生物丰度和多样性的深入研究可以揭示它们在生态系统养分循环中的作用。

材料与方法

样本地点的选择

在卢迪亚纳及其附近的各个村庄中选择了14个不同的地点，如表1所示(以补充页提供)。

土壤样品采集

收集了不同类型的土壤样品，即废土(W)，排土场土(D)，凋落叶(L)，分解有机肥(M)等。样品(500gm)悬浮于无菌聚乙烯袋中，彻底包装，保存于4ËšC。

图2 点击此处查看图

真菌的分离

样品保存在4ËšC的冰箱中，直到分离出真菌。为了分离真菌，在PDA培养基(含有微生物生长所需的所有营养物质的溶液)中加入50 g/ml四环素来抑制细菌和分离板。培养基中添加各种化学成分，接种于28 ËšC孵育。

媒体(g / l)

• 土豆(去皮)- 200
• 葡萄糖- 10
• 琼脂- 15
• pH - 5.6
• 蒸馏水- 1000毫升

真菌菌株的纯化

培养4天后，在PDA培养基上开始出现分离真菌菌落，并在28ËšC上进一步培养4天。无菌捡起纯化菌落并转移到PDA斜面上。在28ËšC孵育4-5天达到最大生长。然后这些斜面被储存在4ËšC的冰箱里。

表1:样本站点的选择

美国没有。	网站名称	网站代码
1	斯德。KoharaTeh:卢迪亚纳区	KO
2	斯德。JandialiTeh:卢迪亚纳区	晶澳
3.	斯德。RamgarhTeh:卢迪亚纳区	类风湿性关节炎
4	斯德。TajpurTeh:卢迪亚纳区	助教
5	斯德。苏尼特:卢迪亚纳区	苏
6	斯德。LaltoTeh:卢迪亚纳区	拉
7	斯德。jhabewalh:卢迪亚纳区	JH
8	斯德。AyaliKhurdTeh:卢迪亚纳区	法国航空
9	斯德。Ayali KalanTeh:卢迪亚纳区	又名
10	斯德。MundianKhurdTeh:卢迪亚纳区	MKH
11	斯德。Mundian KalanTeh:卢迪亚纳区	MKA
12	斯德。MangliucchiTeh:卢迪亚纳区	民大
13	斯德。bastijhodewalh:卢迪亚纳区	BJO
14	斯德。Sunder nagarTeh:卢迪亚纳区	苏

保持纯文化

样品保存在冰箱(4ËšC)，用于真菌鉴定。

理化分析 pH对真菌菌落生长的影响

将真菌样品在不同的pH范围(3、7和9)下生长，考察pH对其生长的影响。在不同的时间间隔测量真菌菌落直径(mm)。

温度对真菌菌落生长的影响

真菌样品在不同的温度范围(25ËšC, 35ËšC, 45ËšC)生长，以检查温度对其生长的影响。

生物化学筛选样品 淀粉酶测定

筛选按照Behl的方法进行et al .,(2006)和雷勒(2004)。在含有1%可溶性淀粉的培养皿上琼脂培养基上进行真菌培养酶活性筛选。培养基凝固后约10mm左右，用软木钻孔机进行无菌钻孔。用粗酶提取物填充孔，在28ËšC垂直孵育96小时。用革兰氏碘溶液浸泡平板，观察井周围的清晰区域。添加热变性粗酶样品保持阴性对照。将酶提取物在110ËšC上煮沸20分钟，然后在冰浴中突然冷却5分钟。用革兰氏碘溶液浸透后，生长线周围的清晰区域表明淀粉水解

纤维素酶测定

筛选是按照Waksman和Fred(1922)的方法进行的。在czapekdox琼脂培养基上筛选真菌培养物的酶活性。培养基凝固后约10mm左右，用软木钻孔机进行无菌钻孔。用粗酶提取物填充孔，在28ËšC垂直孵育96小时。用0.1%刚果红染料溶液浸泡板，观察孔周围有清晰区。添加热变性粗酶样品保持阴性对照。变性是通过在110ËšC煮沸酶提取物20分钟，然后在冰浴中突然冷却5分钟。用0.1%刚果红染料溶液浸泡后，生长线周围的清晰区域表明淀粉水解。

表2:不同pH范围对真菌生长的影响。

时间	Aspergillusglaucus			Aspergillusfumigatus			镰刀菌素sp
	pH值,			pH值,			pH值,
	pH-3	pH-7	pH-9	pH-3	pH-7	pH-9	pH-3	pH-7	pH-9
24小时	0	2	2	0	1.5	0.5	0	2.5	2.5
48小时	0	3．5	3.	0	2.5	2.5	0	3．5	5.8
72小时	0.5	4.8	7.5	0	4．5	4．5	0	4.8	7
96小时	1	9.5	10.5	0	11.5	6.5	1.5	9	8.5
时间	镰刀菌素sp。			Aspergillusnidulans			镰刀菌素sp
	pH值			pH值			pH值
	pH-3	pH-7	pH-9	pH-3	pH-7	pH-9	pH-3	pH-7	pH-9
24小时	0	0	1.5	0	2	2.5	0	2.5	2.5
48小时	0	0	3.	0	2.8	5.5	0	3．5	5.8
72小时	0	2	5	0.8	6	6.5	0	4.8	7
96小时	2.5	3．5	7.5	2	9.5	8	1.5	9	8.5
时间	镰刀菌素sp。			Aspergillusflavus			Aspergillusniger
	pH值,			pH值,			pH值,
	pH-3	pH-7	pH-9	pH-3	pH-7	pH-9	pH-3	pH-7	pH-9
24小时	0	0	1.5	0	1.5	0.5	0	2	1
48小时	0	0	3.	0	3.	3.	0	2.8	2.5
72小时	0	2	5	1.5	7.5	7.5	0	6	4
96小时	2.5	3．5	7.5	1.8	10.5	11	0.5	11	7

蛋白酶试验

筛选的方法是将在脱脂乳培养基上产生的真菌逐个代培养到PDA培养基上，最后转移到PDA培养基上，并在4°C下保持。用真菌选择性培养基(PDA:马铃薯葡萄糖琼脂、麦芽提取物、Czapek和Dox培养基)筛选蛋白酶，其中含有两种不同的蛋白质底物，豆粕(20 g/l)和酪蛋白蛋白胨(10 g/l)。加入这些成分诱导真菌合成蛋白酶，并在24、48、72、96小时后测定其生长情况。

文化鉴定

通过研究其宏观外观、色素沉着和生长速度来鉴定培养物(表5在补充页中给出)。通过目测研究了其颜色、质地、宏观结构、生长区域、地上菌丝和水下菌丝以及菌落地形等重要性状。显微镜下观察乳酚棉蓝染色后的载玻片培养物。基于这些特征的鉴定是按照吉尔曼真菌鉴定手册(吉尔曼J.C . 1995)进行的。

纯化真菌菌株淀粉酶筛选纯化真菌菌株的纤维素酶筛选纯化真菌菌株的蛋白酶筛选 点击此处查看图

结果

纯化真菌菌株的理化特性研究

pH对真菌菌落生长的影响

将真菌样品在不同的pH范围(3、7和9)下生长，考察pH对其生长的影响。在不同的时间间隔测量真菌菌落直径(mm)。

pH是氢离子浓度倒数的对数(Log/H)的符号⁺)，单位是克原子每升。溶液的相对酸度或碱度的量度称为pH值。

pH是决定微生物生长和形态的重要因素之一，因为它们对培养基中存在的氢离子浓度很敏感。生物体的每一种酶系统都有一个特定的pH值范围。pH值也作为酶合成起始和结束的一个有价值的指标(弗里德里希et al .,1989)。

温度对真菌菌落生长的影响

真菌样品在不同的温度范围(25ËšC, 35ËšC, 45ËšC)生长，以检查温度对其生长的影响。在不同的时间间隔测量真菌菌落直径(mm)。

温度是控制酶活性的重要生化因子。选取9株真菌进行温度表征研究。产生蛋白酶活性的最佳温度黑曲霉，黄曲霉，镰刀菌，分别为25-45℃。表中的数据清楚地表明，真菌菌株在25-45°C时蛋白酶活性最高。Ali(1992)也记录了产蛋白酶的最适温度为30℃答:来自烟真菌菌株在30°C以上产生蛋白酶，但产量低于在最佳温度下产生的蛋白酶。这样的温度可能不适合酶的产生。这是按照Daniel的审核et al .,(2010)，他指出，温度升高导致不活动的增加，但活动的增加是有限的，因为温度升高导致活动急剧减少。这可能是由于蛋白质结构的变性。

对纯化菌株进行理化表征，考察pH(3 ~ 9)和温度(25 ~ 45℃)的影响。pH对真菌生长的影响表明，真菌菌株在酸性pH下生长最快。一些菌株曲霉属真菌在碱性pH-9条件下生长最大。它们在4岁时增长最快^th孵育日，孵育后略有减少。制备了表面pH值约为3-9的pH梯度琼脂板。梯度足够稳定，可以区分不同pH值下不同真菌种类的生长特性。pH值对生长速率、孢子形成和色素形成的影响与其他工作者的结果一致。惠勒et al .,(1990)报道了pH值对61株真菌生长速率的影响。四种曲霉属真菌在pH值3-9和温度37ºC范围内生长。在一般情况下曲霉属真菌在观察到的最佳pH值3.0 ~ 9.0和温度(25 ~ 45℃)范围内，研究了温度对真菌菌株的影响。所有菌株的最适温度均为25℃。结果清楚地表明存在中温菌株曲霉属真菌和镰刀菌素sp。发现最大生长发生在4^th孵化日温度升高至45℃后，生长逐渐下降。在不同温度范围内，间隔24 h后定期测定菌落直径。

表3:在选择pH下温度对真菌生长的影响

时间	Aspergillusglaucus			Aspergillusfumigatus			镰刀菌素sp。
	pH-9时的温度			pH-8时的温度			pH-6时的温度
	25 ešC	35 ešC	45 ešC	25 ešC	35 ešC	45 ešC	25 ešC	35 ešC	45 ešC
24小时	9	4．5	1.5	6.5	6.5	2.5	5	4	4
48小时	15	7.5	3.	12	11	4	13	7.5	4．5
72小时	22	15	5.5	20.5	15.5	6.5	24	13	8.5
96小时	30.	17.5	12	30.	22	11.5	33.5	18.5	13.5
时间	镰刀菌素sp。			Aspergillusnidulans			镰刀菌素sp。
	pH-8时的温度			pH-6时的温度			pH-6时的温度
	25 ešC	35 ešC	45 ešC	25 ešC	35 ešC	45 ešC	25 ešC	35 ešC	45 ešC
24小时	7	3．5	3．5	8	2.5	4	3．5	3．5	4
48小时	13	11.5	4.4	15.5	6.5	5	13.5	7.5	5
72小时	25	15	10	17.5	10	7.5	18	15	6.5
96小时	40	16.5	12.5	24	14	14.5	26	18.5	11
时间	镰刀菌素sp。			Aspergillusflavus			Aspergillusniger
	pH-8时的温度			pH-6时的温度			pH-6时的温度
	25 ešC	35 ešC	45 ešC	25 ešC	35 ešC	45 ešC	25 ešC	35 ešC	45 ešC
24小时	8.5	5	5	8.5	4．5	6.5	10.5	4．5	7.5
48小时	12.5	11.5	7.5	15	6.5	8.5	12.5	6.5	9.5
72小时	24	13.5	9	27	11	11.5	25	9.5	12.5
96小时	36.5	16	14	32	15.5	15.5	34	14	16.5

纯化真菌菌株的酶促筛选

酶是通过微生物来源获得的满足人类需要的最重要的产品。酶是生物系统合成的高效、环保的蛋白质催化剂。与化学催化剂相比，它们在催化活性、中等温度下工作的能力和大量生产的能力方面具有显著的优势(Chand & Mishra, 2003)。JockichiTakamine博士(1914)是第一个意识到培养酶的机械可能性并向社会提出的人。虽然他主要关注真菌酶，但Boidin和Effront(1917)是细菌生产酶的先驱。从那时起，微生物酶已经取代了植物和动物的酶(Underkofler, et al. 1957)。

表4:纯化真菌菌株酶促筛选[测定菌落直径(mm)]

美国没有。	鉴定的真菌菌株	淀粉酶筛选淀粉水解试验	纤维素酶筛选刚果红染料试验	蛋白酶筛选
1	Aspergillusglaucus	+ (1.5 mm)	+ (2.0 mm)	-
2	Aspergillusfumigatus	＿	+ (1.0 mm)	+ (8.5 mm)
3.	镰刀菌素sp。	+ (1.5 mm)	+ (2.0 mm)	+ (9.5 mm)
4	镰刀菌素sp。	+ (1.0 mm)	+ (2.0 mm)	+ (9.0 mm)
5	Aspergillusnidulans	＿	＿	+ (10.5 mm)
6	镰刀菌素sp。	+ (1.5 mm)	+ (2.0 mm)	+ (8.0 mm)
7	Aspergillusflavus	+ (1.5 mm)	+ (1.5 mm)	+ (7.5 mm)
8	Aspergillusniger	+ (1.0 mm)	+ (2.0 mm)	+ (8.0 mm)
9	镰刀菌素sp。	+ (2.5 mm)	+ (2.0 mm)	+ (8.0 mm)

从不同土壤样品中纯化出9株真菌，并在最适pH和温度下进行酶促筛选。结果表明，在最佳环境条件下，微生物形态的数量具有多样性，且具有生产淀粉酶的能力．在记录的最佳pH和温度下，对所有纯化的真菌菌株进行淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶的产酶能力筛选。其中大部分菌株是纤维素酶的潜在生产者。最大的酶合成发生在4^th潜伏期，之后逐渐减少。pH和温度对真菌菌株的酶活性有影响。的菌株曲霉属真菌和镰刀菌素sp。是酶的最大制造者。

Chellapandi(2009)报道Aspergillusflavus和Aspergillusterreus作为潜水发酵生产鞣革蛋白酶的潜在菌株。为了提高液体肉汤蛋白酶的产率，对各种培养基成分进行了优化。粗的和部分纯化的蛋白酶初步表征，并用于实验室规模的制革厂脱毛过程。从这些菌株获得的蛋白酶在50ºC的宽碱性条件下表现出良好的活性，表明了在皮革和洗涤剂工业中应用的可能性。

该结果也为净化和应用于各种工业过程带来了希望。这对这些真菌菌株对蛋白质的蛋白质水解分解具有重要意义，可以在酿造、烘焙、纺织和洗衣等各种行业中建立一个强大且具有成本效益的过程。

目前的研究提出了进一步表征这些真菌菌株的酶特性和用于工业应用的希望。

表5:真菌样品鉴定:鉴定真菌培养物及其编码

没有	示例网站	特点	真菌Sp
1	KO / SS / F1;民大/ SS / F1; TA / SS / F2;JH / SS / F3;BJO / SS / F2;SN / SS / F4	生长速度缓慢到中速，菌落质地从软毛到粉状不等，分生孢子头状呈放射状到松散柱状。分生孢子壁光滑。分生孢子椭圆形或圆形。	青绿曲霉*
2	是的/ SS / F1;是的/你/ F1;	菌落在琼脂培养基上分布广泛，呈丝绒状。从	曲霉属真菌
	RA / SS / F2;跨国公司/ SS / F3	绿色到深绿色，随着年龄的增长几乎变成黑色。分生孢子短，通常密被拥挤。块状的分生孢子深绿色，球形。	用烟熏消毒* *
3.	RA / SS / F1;苏/ SS / F2;法国航空/ SS / F2;	它以菌丝的形式生长，菌丝是圆柱形的线状结构。菌丝生长在顶端(尖);新的菌丝通常是由沿着现有菌丝出现的新尖端通过一个称为分支的过程形成的。菌丝是分开的，它们被分成由交叉壁隔开的小室。	镰刀菌素sp * * *
4	助教/ M / F1; SN / SS / F3;跨国公司/ SS / F2	菌落在琼脂培养基中广泛分布，从肉桂色到更深的颜色	镰刀菌sp ****
	JH / SS / F2; MKH / SS / F3	随着岁月的流逝，褐色的阴影像天鹅绒一样舒展开来。分生孢子具光滑的壁，隔。
5	苏/ SS / F1; MKA / SS / F2	菌落在琼脂培养基上广泛铺展暗绿色。分生孢子头状花序短，柱状具光滑壁。块状的分生孢子球形和绿色。	Aspergillusnidulans ^
6	洛杉矶/ SS / F1;洛杉矶/会/ F1	菌落在琼脂培养基上广泛分布，最初为白色，在4-5天后变为绿色，可能呈现各种深浅的浅绿色。营养菌丝，隔。分生孢子是气生菌丝体的分支。	镰刀菌素sp。^ ^
7	又名/ SS / F2;MKH / SS / F2; MKA / SS / F1;维也纳总医院/ SS / F1; KO / SS / F2;RA / SS / F3	菌落在琼脂培养基上广泛分布，生长稀少。分生孢子区域的颜色从香橼绿到木犀草绿不等。分生孢子单独出现，向上展宽，呈颗粒状。每一个群体的头从小的带有几条分生孢子链到大的团块不等。分生孢子几乎光滑。	Aspergillusflavus ^ ^ ^
8	MKH / SS / F1;Sn / ss / f2; ko / ss / f3 ta / ss / f1; su / ss / f3; la / ll / f2; jh / ss / f4 aka / ss / f1	菌落在琼脂培养基中生长迅速，淹没菌丝丰富，分生孢子光滑，隔生。分生孢子头状花序为黑棕色到碳质黑色，从链状的小分生孢子块到球形或辐射状头状花序不等。	Aspergillusniger¤
9	JH / SS / F1;BJO / SS / F1; SN / SS / F1	菌落在琼脂培养基中生长迅速，颜色为白色，呈膜状。菌丝是分开的。分生孢子体短，直立，在顶端产生链状的分生孢子。	镰刀菌

讨论

微生物生态学的主要目标是了解自然栖息地的微生物多样性;因此，微生物和栖息地的知识是必不可少的。共选择14个站点采集样本进行真菌菌株的分离，真菌培养数量较多，分别见表1和表2。从14个样点共分离到42个真菌培养物。经过关键的形态学观察(菌落颜色，菌落形状，色素沉着，5天内的生长模式)和显微镜观察，发现许多真菌培养物相似，发现存在于多个位置，并以不同的上标表示。鉴定的真菌菌株有:烟曲霉、绿曲霉、灰曲霉、镰刀菌、黑曲霉。结果表明，卢迪亚纳地区微生物群落丰富。上述结果也证实了早先Goyal所做的分离研究等2008年,耆那教徒的等2005.pH值对生长的影响Aspergillusglaucaus和AspergillusfumigatuspH-9(碱性pH)时生长最大。测定菌落直径为11.5mm。48h后生长加快。96h后开始产孢。Aspergillusflavus结果表明，最佳pH值为酸性pH-6。96 h后测定菌落直径12.5。48h后显微镜下观察到绿色孢子。在真菌菌株中观察到类似的结果。最适pH为6，测得菌落直径为12.5。96 h后开始产孢。表1和表2的数据表明Aspergillusfumigatus在25℃碱性pH值(即8)下生长最快。间隔24 h后测定菌落直径。在25ºC条件下，96小时后最大菌落直径为30 mm。中温真菌菌株，Aspergillusfumigatus在25℃的酸性pH值(即6)下生长。当温度升高至45℃时，生长速度下降。结果表明，在pH值为8的条件下，生长的最佳温度为25℃镰刀菌素sp。96 h后测得最大菌落直径为40 mm。中温真菌菌株的存在Aspergillusnidulans．让真菌样品在其最佳pH(即6)下生长。发现记录的最佳温度为25ºC，最大菌落直径为24 mm。的张力Aspergillusflavus＆Aspergillusniger．在酸性pH值(即6)下，最佳温度为25℃。将温度升高至45℃后，观察到的生长很少。

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