当前世界环境

介绍

蓝藻产生的藻华对下层有遮阳作用，导致水面以下呼吸活动增多，使动物群窒息。^1、2一些淡水藻类微囊藻、小球藻、毛线虫和Phormidium是有害的，因为它们产生的生物质会产生难闻的气味，导致脱氧和损害水生生物。^3.某些种类的微藻生长过快，特别是Microcystics和螺旋藻导致水中缺氧。Phormidium众所周知，水华会使盐变质，使盐水呈现红色和难闻的气味，还会使盐水糊化，导致盐水溶液无法结晶成盐。⁴在农业中，这些水不能用于灌溉、家畜饮用水源和作物加工。^5、6这些水花还会产生一种叫做土臭素的物质，散发出难闻的气味，从而使水无法用于家庭和娱乐。⁷蓝绿藻通常与鱼类的异味问题有关，因为土臭素和甲基异龙骨(MIB)会给鱼类带来不良的味道。^8、9藻华还与有害的小分子——蓝藻毒素的产生有关。蓝藻毒素在水生食物链中生物积累，并对整个营养水平的水生生物构成严重威胁。¹⁰人类和其他陆生生物接触到蓝藻毒素是由于摄入了被这些毒素污染的饮用水，尽管人类也可能在食用了在其组织中积累了大量蓝藻毒素的海产品后接触到蓝藻毒素。霍格兰进行的研究et al .,(2002)显示，蓝藻产生的微毒素可在海产品中生物积累，当人类最终以海产品为食时，会导致中毒。^11、12研究进一步表明，不同的蓝藻产生不同的蓝藻毒素，对人体有不同的影响，其中包括丝囊藻属flos-aquae它们会产生一种被称为蛤毒素的蓝藻毒素，这种毒素会导致人类麻痹性贝类中毒。^13、14项圈藻flos-aquae产生一种神经毒素，叫做阿那托毒素，会影响神经突触。¹⁵Lyngby amajuscula产生一种被称为褐藻毒素的毒素，它是导致游泳者瘙痒的原因:一种以眼睛和鼻子粘膜炎症和肿胀为特征的疾病。¹⁵蓝藻产生的其他一些毒素具有重要的医学意义，包括结节素、微囊系统素、柱状精子素、舌虫毒素、脂多糖和失语毒素，因为它们在哺乳动物体内的靶器官包括肝脏、胃肠道、皮肤和任何暴露的组织。^{16日至18日}

由于持续采用以工业为基础的生活方式，污染物不断排放到水生环境中，导致富营养化，从而鼓励蓝藻生长到内陆水域，而内陆水域是全球范围内重要的饮用水来源。^14、19随着人们对娱乐用水和饮用水中蓝藻毒素影响的不断认识，人们对开发一种检测水生环境中蓝藻毒素的有效方法进行了大量的研究。^{20 - 22}有许多方法可用于发现水生环境中的蓝藻毒素，但大多数方法不容易获得，并且需要复杂的实验室专业知识才能使用。²²目前已有相当多的生物方法可用于水生环境中蓝藻毒素的检测，但大多数方法对有效检测水生环境中蓝藻毒素存在一定的局限性。^23日,24日这一小型审查的目的是总结新兴的方法使用，以揭示蓝藻毒素在水生环境和如何有效的方法是在任务的性能。

水生环境中蓝藻毒素检测的生物分析方法

蓝藻中的生物分析方法是指用于收集、储存、处理或分析蓝藻材料的方法。²⁵该方法可用于水生环境中蓝藻毒素的检测。²⁵用于检测蓝藻毒素的两种主要生物分析方法是酶联免疫吸附法(ELISA)和蛋白磷酸盐抑制法(PPIA)。酶联免疫吸附试验包括使用抗体来识别水生环境中的蓝藻毒素。²⁶这种方法很容易获得，不涉及使用复杂的实验室设备，有效地检测环境中的蓝藻毒素。ELISA可用于检测环境中极低浓度的蓝藻毒素(µ/l)。cyanotoxin的原则使用ELISA检测涉及到水的混合样本包含cyanotoxin用液体试剂在反应室是指井(图1)。包含反应物和防止溢出导致反应物之间的生化反应产生一个信号用于确定样品中微囊藻毒素的浓度从水生身体收集使用分光光度计波长450 nm系列孵育和洗涤。²⁷ELISA法检测水体中蓝藻毒素的局限性在于该方法不能识别水体中蓝藻毒素的种类，不能准确测定水体环境中蓝藻毒素的毒性水平。蛋白磷酸盐抑制试验是一种生物学研究程序，用于研究微囊藻毒素与蛋白磷酸1 (PP1)和蛋白磷酸2A (PP2A)结合的潜力，但现在可用于检测环境样品中微细胞素和结节素的作用。²⁸PPIA法检测水生环境中蓝藻毒素是一种有效的方法，可以检测到低至0.1µg/l的蓝藻毒素，由于该方法的灵敏度，该方法已被证明是非常快速和容易的，但目前尚无可用的PPIA试剂盒。²⁹该方法具有较高的检测效率，可以检测出超过ELISA和LC-MS/MS检测限的毒素。²⁹PPIA法检测蓝藻毒素的数据与高效液相色谱法(HPLC)的使用呈正相关。使用PPIA识别蓝藻毒素的局限性是某些变体无法与蛋白磷酸酶反应，导致环境样品中毒素浓度的高估，或者有时无法检测到这种变体的存在。^30.

图1:ELISA法检测水生环境中蓝藻毒素的方法示意图 点击此处查看图

水生环境中蓝藻毒素的分子检测方法

分子方法是一种方法，涉及检查和操作的脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，蛋白质和蓝藻的脂质。基于杂交和聚合酶链反应(PCR)技术，建立了水生环境中蓝藻毒素的检测方法。杂交方法涉及到的基因相似性的测量存在于蓝藻细胞形成开花的DNA序列之间。该方法对蓝藻生产的产品中不同种类的蓝藻毒素的鉴别是有效的，但由于耗时长，且在简单的实验室条件下难以实现，尚未在世界范围内得到应用。聚合酶链反应是另一种用于水生环境中蓝藻毒素检测的分子方法，该方法涉及到DNA序列的扩增，产生许多DNA片段的拷贝，因此灵敏度很高。这种方法在水华发生前很久就能测定水样中蓝藻毒素的含量。分子方法检测蓝藻毒素的局限性是，它可能会给出一个误导性的结果，特别是当蓝藻的DNA是轻微污染。用于PCR反应的酶也容易出错，这可能导致PCR片段发生突变，从而导致误导性结果。^33节

水生环境中蓝藻毒素的生物检测方法

生物测定法是一种利用活细胞或活组织测定水生环境中蓝藻毒素浓度的检测方法。该分析是基于蓝藻毒素对包括无脊椎动物、脊椎动物、植物和微生物在内的生物组织的影响的定性和定量测定。生物测定可用于区分肝毒素和神经毒素通过确定的LD50值的蓝藻毒素。³⁴这些方法可以用来确定一种未知的蓝藻毒素的毒性水平，因为在水生环境中已经发现了大量的蓝藻毒素，尽管由于蓝藻产生的毒素的结构变异，毒素的生物活性(有效的肝毒性、细胞毒性、酶活性以及免疫相互作用)并没有很好的记录。用于检测水生环境中蓝藻毒素的生物测定方法包括利用微生物、无脊椎动物、脊椎动物和植物提取物。³⁵

利用无脊椎动物进行生物测定

然而，使用不同的实验技术，如生存，饲养抑制，种群增长率等，蓝藻的毒性可以分配。在进行基于水蚤的生物测定之前，必须先将蓝藻菌落或大菌丝破坏，因为大菌落和大菌丝会对水蚤造成机械干扰和摄食不足，而且死亡率可能不能反映出蓝藻的毒性。³⁶此外，对6种微囊藻毒素同系物(包括MC-LR)进行了急性毒性和蛋白磷酸酶抑制试验Thamnocephalus platyurus，两者之间没有相关性。[D-Asp3， (E)-Dhb7] MC-RR毒性最大，但蛋白磷酸酶活性弱得多。研究表明，除抑制蛋白磷酸酶外，还有其他机制在MC诱导的毒性作用中起作用Thamnocephalus platyurus。蚊子成年和幼虫的消费也被研究作为可能的生物测定系统对抗蓝藻毒素。幼虫的伊蚊aegyptii被发现受到来自蓝藻的神经毒素和肝毒素的影响。的成年人库蚊pipens被发现对MC-LR敏感。这两种蚊子比较微妙，但由于处理这种生物的复杂性，尚未广泛实施。同样，成年家蝇(苍蝇座sp。)、菱形背蛾(小菜)及棉叶虫(Spodopterasp.)被发现对MC-LR敏感，当插入去污染的毒素时，天然样品的阳性结果与小鼠毒性结果和各种杀虫剂相似。然而，这种苍蝇很难处理，而且需要显微注射，这很难管理。³⁷

利用脊椎动物进行生物测定

在过去的二十年中，小鼠生物测定法得到了广泛的应用，并且仍然是微囊藻毒素检测中最受欢迎的生物测定法。雄性瑞士白化病小鼠仍然是最常用的菌株，以确定毒性的蓝藻毒素。通过腹膜内注射蓝藻细胞裂解液检测毒性。如果要注射的量为0.5 ml或更大，则优选在生理盐水溶液中制备的样品。小鼠静养24 h，然后颈椎脱臼处死。在观察期结束时对肝组织进行尸检是必要的，因为肝毒素表现出肝损伤的特征性症状。已知这些肝毒素可引起肝毒性症状，其特征是肝实质变性和空泡化、充血和出血以及肝空泡化。此外，在没有症状的情况下，或小鼠在观察期后存活的情况下，可检测血清中关键肝酶(谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)、谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)、碱性磷酸酶(ALP)和乳酸脱氢酶(LDH)的渗漏情况。为此，在牺牲小鼠之前从眶后神经丛采集血液，并使用市售诊断试剂盒在血清中检测肝酶。³⁸柱体精子蛋白酶表现为器官逐渐衰竭，尤其是肝、肾等器官衰竭，症状持续时间较长，需要较长的观察时间。研究已经将急性肝毒性与严重的肝、肾和胸腺损伤与澳大利亚柱精子蛋白酶产生菌株联系起来。肝脏组织学检查仅显示中度和多灶性坏死。小鼠毒性用LD表示₅₀毒素或蓝藻的干重mg / kg小鼠体重和LD₅₀干重<1000毫克的蓝藻被认为是无毒的。³⁹使用小鼠实验的第一个主要缺点是需要动物室设施来饲养用于常规实验的动物。其次，在毒性研究中使用动物是违反科学伦理的，在大多数国家实际上是被禁止的。此外，当环境中存在不止一种蓝藻毒素时，作用更迅速的毒素(即微囊藻毒素- lr)可能会掩盖其他症状。但是蓝藻的总体毒性可以用小鼠生物测定法估计饮用水供应。鱼类也会受到蓝藻毒素的影响，包括肝损伤、离子调节紊乱、行为改变和死亡。据报道，年轻的褐鳟、罗非鱼和鲤鱼是最敏感的鱼类，可以作为对蓝藻细菌的测试系统。与小鼠生物测定不同，鱼类生物测定可能不容易和敏感。对鱼类注射蓝藻提取物是一项艰巨的任务，浸泡在含有蓝藻提取物的培养基中可能需要更多的蓝藻提取物才能达到致死效果，并且可以通过多种方式解毒来降低口服毒性。与小鼠生物测定法类似，蝗虫处理起来比较安静，可以小剂量(10 μl)注射给药。结果，以麻痹性中风为特征，在90分钟内获得。⁴⁰LD的₅₀虫草毒素的浓度为8 μg g-1，但对微囊藻毒素lr和阿那托毒素a均不敏感。此外，所选择的蛤蚌毒素类似物的相对毒性与在哺乳动物系统中报道的不同。作者讨论了将蝗虫作为一种简单、伦理上可接受的、广泛特异性的功能性生物测定方法，用于监测蛤毒素和其他麻痹性贝类毒素。⁴¹

利用细胞培养进行生物测定

由于包括哺乳动物在内的大多数脊椎动物都以各种方式受到有毒蓝藻的影响，因此使用培养的哺乳动物细胞代替动物进行生物测定已成为动物生物测定的适当替代品。微囊藻毒素是导致急性肝损伤的原因这一事实的确立鼓励了使用肝细胞(肝细胞)的研究。⁴²毒性是通过肝细胞中乳酸脱氢酶(LDH)的漏出来确定的。⁴³通常，将分离的大鼠肝细胞与纯毒素或bloom提取物一起孵育指定时间，然后使用(3,4,5 -二甲基噻唑-2基)- 2,5 -二苯基溴化四唑(MTT)试验来测量细胞的实用性。该生物测定提供了第一份与微囊藻毒素结构变化进行毒性比较的鉴定报告，并表明MC-LR毒性最大，MC-RR的毒性至少比MC-LR低100倍。³⁹

利用植物和植物提取物进行生物测定

次级代谢物包括由蓝藻和微藻产生的微囊藻毒素已被证明具有杀藻或除草的特性。生物测定使用阿纳斯提，紫堇，肺气肿和小球藻已被用于研究由颤藻属。然而，关于饮用水中蓝藻毒素的成本效益和敏感性的植物生物测定方法的文献很少或没有。锅等.，(2002)研究了微囊藻毒素- lr提取物对Lepidium一超过6天。当暴露于10μg L-1微囊藻毒素- lr浓度时，与对照相比，根和叶长度以及幼苗的新鲜重量大幅减少。³⁷谷胱甘肽s -转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性也显著升高。研究表明Lepidium一生物测定法可用于对抗微囊藻毒素，尽管除MC-LR和其他蓝藻毒素外的微囊藻毒素的作用尚未包括在研究中。这种生物测定法的应用还需要大量的探索。柱状精子蛋白酶对烟草花粉的萌发有负面影响(烟草cv Samsun NN)。圆筒精子素在5 ~ 1000 μ ml−1范围内对花粉萌发有抑制作用。对烟草花粉萌发的抑制作用可作为柱状精子素的生物测定方法，但该方法需要预先浓缩步骤，以检查来自水生环境的样品。⁴⁴

酶生物测定

据报道，微囊藻毒素和结核素可抑制蛋白磷酸(PP) 1和2A。因此，蛋白磷酸酶抑制试验已被证明是微囊藻毒素和结核素的一种精细筛选方法。微囊藻毒素与PP1和2A的结合同样良好。早期版本的PP1和2A生物测定是基于从放射性标记底物释放的32p -磷酸盐的定量。该生物测定法对亚纳米克水平的微囊藻毒素和结节素敏感。该技术也已成功地用于环境样品中微囊藻毒素的定量，如饮用水之前和之后的水处理。该方法灵敏度高，但由于使用了放射性底物，需要专门的实验室设备和法规，因此没有得到广泛应用。⁴⁵

分析方法测定蓝藻毒素

高效液相色谱法(HPLC)是检测水生环境中蓝藻毒素最可靠的方法，该方法可以将毒素分为毒素种类和变体。⁴⁶高效液相色谱法检测蓝藻毒素的局限性是价格昂贵且难以获得。⁴⁷动物组织中蓝藻毒素的浓度测定通常采用紫外、光电二极管阵列(PDA)和/或质谱(MS)检测器的高效液相色谱(HPLC, LC)技术。⁴⁸这些方法允许根据保留时间进行更详细的鉴定，但有进一步的限制，包括由于纯化、浓缩和商业蓝藻毒素标准的缺乏而导致的检查时间延长。⁴⁹该方法对低浓度、连续样品调查的蓝藻毒素的快速测定效果不佳。采用直接水进样的高效液相色谱-质谱联用技术可以快速检测水生环境中不同形式的蓝藻毒素，因为该方法不需要在分析前对样品进行纯化。^50岁的51采用固相萃取(SPE) -液相色谱(LC) -质谱(MS)技术对9种氰藻毒素进行分离和同时检测，对水生环境中氰藻毒素的监测具有较好的效果。⁵²

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术可以快速识别特定的微囊藻毒素变体。与高效液相色谱法或生物测定法相比，由于省略了纯化步骤，该技术消耗的时间更少，所需的样品量(微克与毫克)更少。³⁸气相色谱(GC)技术是建立在微囊藻毒素氧化的基础上，使Adda ((2S, 3S, 8S, 9S)-3-氨基-9-甲氧基- 2,6,8 -三甲基-10-苯基- 1,6 -二烯酸)侧链分裂，生成3-甲氧基-2-甲基-4-苯基丁酸(MMPB)，然后通过GC,GC/MS或HPLC/荧光检测。⁵³Kaya和Sano(1998)的研究发现，该方法的检出限约为微囊藻毒素- lr中表达的微囊藻毒素总浓度的0.4µg，但发现其检出限取决于水的浓度。毛细管电泳(CE)用于含氰毒素的生物混合物的分离和定量，但与高效液相色谱(HPLC)相比，这种方法的灵敏度较低。⁵⁴“瓦萨”号et al .,(2004)展示了CE在复杂矩阵分析中的应用。研究表明，该方法应与胶束电动色谱等其他分析方法相结合。基于微囊藻毒素的紫外光谱特征，薄层色谱(TLC)检测方法类似于HPLC的PDA检测方法。⁴⁶有适当的检测系统;可以记录分离组分的紫外光谱。不同的薄层色谱分离微囊藻毒素的技术已被报道。⁵⁵TLC可以给出毒素的定量结果，但这种方法应该被视为一种筛选技术，有待于额外的开发。利用实时荧光定量PCR技术对水生环境中的毒素基因进行了定量分析⁵⁶。⁵⁷建立了一种定性技术和分子技术相结合的快速、精确的方法，可用于有害藻华群落内多种物种的检测。该方法设计了14个物种特异性探针和4组特异性引物。利用流式细胞仪和彩色编码微球实现了多重同时检测，微球与所开发的探针结合。通过平行双PCR扩增，在单一反应中使用通用引物，在多重检测中使用一组物种特异性引物，实现了成本效益高且高度特异性的分析。这种多格式需要不到4小时的时间来完成样品收集，并且可以在单个样品中同时识别多达100种不同的物种。⁵⁵

结论

比较了生物分析法、分子法和生物测定法等水生环境中蓝藻毒素的定量方法，以及分析方法在水生环境中蓝藻毒素定量中的应用效果。虽然分析方法在水生环境中蓝藻毒素的测定中非常有效，但这些方法需要高水平的实验室技能和专业知识，而生物分析方法、分子方法和生物测定方法在水生环境中蓝藻毒素的定量中具有高度敏感、易于获取和有效的特点。这些新兴技术是预防藻华毒性的重要工具，因为它们具有在藻华发生之前检测水生环境中微毒素存在的能力。这些研究还表明，水生环境中蓝藻毒素的生物检测方法存在局限性，尽管需要高技能才能实现这一目标，但分析方法仍是水生环境中蓝藻毒素检测的最佳选择，因此建议开展更多的研究，以消除使用生物方法检测水生环境中蓝藻毒素所面临的挑战。

确认

第一和第二作者感谢卡诺巴耶罗大学生物科学系。

资金

作者在研究、撰写和/或发表本文时未获得任何资金支持。

利益冲突

作者没有任何利益冲突。

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