当前世界环境

介绍

在现代世界，用于保护作物的杀虫剂导致了作物产量的增加。然而，各种农药的不科学使用直接或间接地影响了环境中各种形式的生命。上个世纪以来，为了提高农业生产力，人们一直在使用持久性有机氯农药(OCPs)。这些ocp是持久性有机污染物及其代谢物仍然存在于环境中具有诱变和致癌作用。¹

硫丹(6,7,8,9,10,10-六氯-1,5,5a,6,9,9 - a-六氢-6,9-甲烷-2,4,3-苯并二氮-3-氧化物)是20世纪50年代引进的第一代有机氯农药，1954年在美国获得批准使用。以7:3的比例存在于α-硫丹或硫丹(I)和β-硫丹或硫丹(II)两种同分异构体中，杀虫活性几乎相同，但理化性质有显著差异。^{2 - 4}它是一种广谱杀虫剂，用于水果、蔬菜、棉花和观赏植物，以控制白蝇、蚜虫、叶蝉、马铃薯甲虫、蛾幼虫和卷心菜虫。⁵硫丹及其有毒残留物硫酸硫丹具有生物蓄积性，可通过多种途径进入食物链。硫丹的两种异构体和其他代谢物如图1所示。

图1:硫丹异构体的结构及其主要代谢物 点击此处查看图

2011年《斯德哥尔摩公约》将硫丹列入持久性有机污染物(POPs)，因为硫丹对大多数生物体具有高毒性和生物蓄累性，并被证明可以从其原始来源转移到环境中的长距离，通过哺乳动物的性腺毒性、遗传毒性和神经毒性影响偏远地区的人类和野生动物种群。^{6 - 7}印度是70%硫丹的供应国，其市场价值约为3亿美元，也是最大的硫丹消费国，其7500万农民每年消耗9000吨硫丹，使其成为世界上最大的消费国。由于其对人类和其他非目标生物的毒性，自2011年以来，印度已禁止其在印度各地的生产、使用和销售。由于硫丹的疏水性、持久性和生物蓄积性，硫丹与土壤有很强的结合，其残留物将在土壤中停留较长时间。⁸早期的研究表明，在印度和世界各地的各种农业土壤、水和其他环境样本中都存在硫丹异构体和硫酸硫丹。^卖地这些发现表明各种环境样本受到硫丹及其代谢物以及其他杀虫剂的污染。

在印度卡纳塔克邦Dakshina Kannada地区的Puttur、Belthangady、Sullia和Bantwal Taluks的许多村庄，人们在腰果树上施用硫丹以保护腰果免受蚊虫侵害。据卡纳塔克邦腰果发展有限公司称，从1980年到2000年，该地区850(850)公顷的腰果种植园空中施用了36000多升硫丹，另外还有11000升手工施用。施用的杀虫剂在土壤中停留的时间更长。硫丹的半衰期被认为超过100年。¹⁴

生物修复或生物强化是利用微生物去除有毒污染物的一种生态友好的方法。一些已报道的利用微生物进行硫丹生物降解的研究有:^{15 - 23}细菌和真菌被认为是去除污染物的潜在候选者，因为它们利用它进行新陈代谢。²⁴本土细菌和真菌能够去除污染土壤中的有毒物质，是一种很好的生物增强剂，而且它们对其他本土动植物不会构成严重威胁。²⁵在这方面，本研究是为了分离能够完全降解硫丹的本地细菌而进行的。

材料与方法

土壤采样

土壤样本采集自卡纳塔克邦Dakshina Kannada区的Belthangady Taluk的Kokkada、Patrame和Nidle村的腰果种植园，土壤暴露在硫丹中数十年。土壤样品采集于同一块腰果种植园的不同地点(图2)。收集的土壤样品保存在有标签的聚乙烯盖中，带到实验室进行实验分析。然后，将样品风干，通过2mm筛网进行筛分，并在4´°C保存，待进一步使用。土壤基本特征如表1所示。

化学物质

分析级α-硫丹(99.6%)和β-硫丹(99.8%)来自美国Sigma-Aldrich公司，作为标准品。将各异构体的原液(100ppm)分别配制成HPLC级n-己烷:将约1mg (Acculab ALC210.4)分析物称重至10ml容瓶中，稀释成体积。标准液储存在- 20°C的暗箱中。根据需要准备了工作解决方案²⁶。

图2:硫丹采样位置地图 在印度卡纳塔克邦的Dakshina Kannadadistrict (地图不按比例)。 点击此处查看图

表1:从硫丹污染地点采集的样品的基本土壤特征。

村	土壤收集点	样品名称	碳
Kokkoda	腰果种植园	k - 1	0.033	5.46	1.4	14.6	0.118
		K-2	0.038	5.34	1.5	11.1	0.352
		k3	0.044	5.57	1．1	12.4	0.226
		K-4	0.025	5.60	1.6	8.5	0.295
Patrame	腰果种植园	p - 1	0.015	5.84	1．1	10.1	0.132
		p 2	0.023	4.50	1.8	11	0.155
		P-3	0.061	4.45	1.2	9.1	0.183
Nidle	腰果种植园	n - 1	0.085	4.35	2.3	11.2	0.195
		n -	0.007	5.22	1.6	13.3	0.525
		n - 3	0.032	5.30	0.9	12.5	0.230

硫丹降解菌株的富集与分离

为进行分离，取Dakshina Kannada地区腰果种植园硫丹污染场地土壤样品1g，接种于250ml Erlenmeyer烧瓶中，瓶中含有100 ml成分为(g/l) K的非硫培养基(NSM)₂HPO₄0.225 g, KH₂阿宝₄0.225 g,在北半球₄Cl 0.225g, MgCl₂.6H₂O 0.845g, CaCO_3.0.005 g, FeCl₂.4H₂O 0.005, d -葡萄糖1.0gm，微量元素(mg/l) MnCl溶液1ml₂.4H₂O 198mg, ZnCl₂136毫克,CuCl₂.2H₂O 171mg, CoCl₂.6H₂O 24mg，镍₂.6H₂O 24毫克^[27]以100mg/l硫丹为唯一碳源，pH为7.5，在摇床中，37°C, 120 rpm孵育7天。孵育7天后，将1ml样品重新接种到100ml新鲜培养基中，添加100mg /lendosulfan。第四次富集后，将样品铺在含有100mg/l硫丹的1.5%琼脂矿物培养基上。对分离得到的纯种强效菌株进行了形态和生化鉴定，并与Bergey的系统细菌学手册进行了比较²⁸。

生物降解研究

选择在NSM琼脂板上生长良好的纯强效菌株ES-1进行硫丹异构体的生物降解。包含100毫升,250毫升瓶的销售经理中接种细胞球应变ES-1(10毫升的一夜之间文化是在15毫升离心管,离心10分钟。然后在5000 rpm,上层清液被丢弃和细胞颗粒溶解1毫升无菌经理介质和添加至瓶无菌)以及70 mg / l(α异构体和30 mg / l的β异构体和孵化的杀虫剂在37提取介质进行了根据²⁹稍微修改一下。孵育7 d后，取35ml液体培养基于50ml离心管中。试管10000 rpm离心5min，用石油醚摇瓶法分离上清。然后，将有机水层穿过(~2 gm)无水硫酸镁。然后用旋转蒸发器(buchi型，GG Technologies，印度)浓缩溶液。同样，孵育14天后，用同样的方法提取样品。将其溶解于HPLC级正己烷中，通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)进行分析。

最佳降解研究

根据实验结果，确定了菌株ES-1对硫丹的最佳降解条件^30.稍微修改一下。在不同温度(37和55 °C)和不同硫丹浓度(100、250和500 mg/l)下进行降解研究。所有实验均在含有NSM介质的250ml烧瓶中进行，其中硫丹为唯一碳源。在第14节结束时检查培养基的pH^th的一天。实验与对照一起分三次进行。按照上述方案进行提取。

土壤中硫丹降解的微观研究

在土壤微观研究中，土壤样本采集于迈索尔大学校园，该校园以前没有施用过农药。采集的样品用2mm筛网筛去杂物。然后，将100 gm土壤样品置于250 ml的Erlenmyer烧瓶中，在121°C下高压灭菌20分钟。该过程重复三次，使土壤中没有其他微生物。随后，在土壤样品中加入100 mg kg¹用含有10⁶细胞转基因¹的芽孢杆菌ES-1 sp。同样，对照瓶中不添加细胞培养物。孵育7-14天。每隔一段时间加入10毫升无菌水使烧瓶湿润。然后根据¹摇瓶法。取10 g土壤于250 ml Erlenmeyer烧瓶中，加入50 ml石油醚和丙酮(1:1,v/v)，置于卧式摇床中过夜。之后，提取物被过滤，并保存在烧杯中蒸发干燥。将残留物溶解于1ml HPLC级正己烷中，采用气相色谱-质谱分析。

残留分析

采用7890A气相色谱系统(Agilent Technologies, inc .)与Synapt G2 HPMS (Waters, USA)的质谱联用，并配备电子喷雾电离(ESI)检测器进行GC-MS分析。气相色谱柱为HP-5MS毛细管柱，尺寸为30m × 0.250mm (Agilent Technologies, inc .)。GC-MS是根据。³¹设定烤箱温度从120 °C升高到320 °C，最小温度为10 °C¹。在70 ev全扫描模式下记录质谱。通过比较内标的保留时间，对样品中存在的硫丹进行定性分析。进行了回收率研究，以评价上述方法的效果。α硫丹和β硫丹的平均回收率分别为93%和91.2%。

菌株ES-1的鉴定(DNA分离及16S rDNA扩增)

DNA是从菌株中分离出来的³²采用聚合酶链反应(PCR)对菌株16S rDNA基因进行扩增³³，通过正向(BS F: GAGTTTGATCCTGGCTCA GG)和反向(BS R: TCATCTGTCCCACCTTCGGC)。利用BLAST基因数据库(http://www)对DNA序列进行分析。ncbi.nlm.nih.gov)，并将序列提交到GenBank。将部分测序数据提交到Genbank，登录号为KX230063。

结果与讨论

硫丹降解细菌分离物的分离

采用土壤富集法分离微生物培养，分离出能耐受高浓度硫丹的菌株。在三个村庄的样本中，我们只能从Patrame村分离出细菌。在富集培养基中反复继代培养后，ES-1微生物分离物在富集培养基中显示出大量生长，表明利用硫丹作为生长基质。

ES-1的鉴定

ES-1鉴定为革兰氏阳性兼性厌氧杆菌形状(图3)，不运动，过氧化氢酶阳性，在含有硫丹的NSM琼脂上呈现乳白色菌落形态。将分离的DNA进行PCR扩增。根据16s rDNA序列鉴定该细菌为芽孢杆菌sp。利用Mega软件采用邻居连接法构建的系统发育树显示菌株es -1 (KX230063) 99%的查询覆盖率为芽孢杆菌thermoamylovorans(KJ842641)(图4)。然而，其他分子证据还有待进一步研究，以确定菌株ES-1是芽孢杆菌thermoamylovorans。

图3:细菌分离ES-1的显微图像 光学显微镜(Allwin sciences)，印度[油浸(100倍)] 点击此处查看图

分离菌ES-1降解硫丹的研究

利用ES-1菌株对硫丹异构体(α和β)的降解进行了评价。GC-MS分析显示，经过14天的培养，菌株ES-1能够完全代谢硫丹而不形成任何已知的中间体。该结果是基于对GC-MS色谱所得峰总数的比较分析。(Fig.5a)。色谱仪“a”为标准硫丹的总离子色谱仪，α-硫丹保留时间为11.21，β-硫丹保留时间为11.74,m/z为406(图5b.)。色谱仪“c”(图5c.)表示用m/z 390孵育14天后从烧瓶中取出的样品。

图4:系统发育树使用 16S rDNA部分序列与 基因库中相似性最高的菌株 (括号内的加入编号)。 点击此处查看图

在以硫丹为硫源的矿物介质中，能够去除亚硫酸盐基团并以其为硫源的生物能够生存和繁殖。^30.它还导致减少化合物的毒性，这有助于化合物的解毒。各种细菌和真菌分离物在好氧条件下对硫丹异构体的微生物降解进行了大量的研究。硫酸硫丹、二醇硫丹、硫丹醚、硫丹羟基醚、硫丹内酯、硫丹单醛和硫丹双醛是硫丹异构体微生物降解过程中形成的主要代谢物。^23日,34这两种分析结果都有力地支持es -1菌株对硫丹的完全降解。

最佳生物降解研究表明，菌株在55 °C的温度下比在37 °C的温度下生长得更好(数据未显示)。结果表明，芽孢杆菌sp. ES-1是一种在酸性土壤中生存的嗜热细菌。菌株ES-1在100 mg/l时的最大降解率>90%(图5)，是相同浓度下硫丹的高效生物降解菌。培养14天后，培养基的pH值降为酸性(表2)。浓度为100 mg/l的硫丹比浓度为250和500 mg/l的硫丹对pH的降低更大。在硫丹降解过程中，pH值从中性变为酸性也被许多其他研究人员观察到。^6日,35这可能是由于代谢活动增加导致酸性代谢物的形成。

图5a:标准品α和α的GC-MS、总离子色谱图(TIC) β硫丹b.硫丹的质谱c)质量破碎 14天后获得的代谢物 点击此处查看图

压力芽孢杆菌sp. ES-1遵循水解途径进行生物降解，不形成任何已知的代谢物。结果表明菌株ES-1采用水解途径对硫丹进行生物降解;³⁶与硫丹生物降解的氧化途径相反，在氧化途径中形成硫酸硫丹。^37-39在降解过程中，培养基中没有任何特定的代谢物积累，这可能表明硫丹可能通过形成一些极性代谢物而完全矿化。同样，在硫丹降解过程中没有观察到代谢物根癌土壤杆菌PT-3暗示了利用杀虫剂作为碳源的独特基因和酶组的可能性。^20.AchromobacterxyloxidansC8B还能矿化浓度为50ppm至20ppm的硫丹和硫酸硫丹的异构体^th在液体培养基中培养一天。^30.细菌菌株完全矿化硫丹葡萄球菌sp。芽孢杆菌circulans我们研究过I和II。这些菌株被发现是硫丹及其代谢物的优秀降解者。杀虫剂的矿化过程中可能存在水解途径，形成碳离子或羧酸乙酯，然后转化为简单的碳氢化合物。⁴⁰

图6:菌株ES-1在NSM中的生长情况 不同浓度的硫丹 点击此处查看图

表2:孵育14天后(初始pH为7)，pH值下降。

Sl.No。	农药浓度(mg/l)	14天后的pH值
1	One hundred.	3.773
2	250	4.680
3.	500	4.840

的生物降解能力芽孢杆菌测定了土壤中sp.ES-1菌株中硫丹α和β异构体(100 mg/kg)的含量。该分离物在7 d内降解50%的化合物，14 d后完全矿化。未检测到累积产物。而对照烧瓶提取物则显示出两种异构体m / z相当于硫酸丹质量的423。这说明菌株在硫丹矿化过程中遵循水解途径。在非生物条件下，化合物将其氧化为硫丹硫酸盐。先前的研究表明，通过水解，这两种异构体都被水解成硫丹醚和二醇²⁷和硫丹硫酸盐通过氧化⁴¹。混合细菌联合体能够矿化硫丹的异构体而不形成任何已知的中间代谢物⁴⁰与此相反;硫丹硫酸盐是由芽孢杆菌sp。⁴²在生物强化或生物修复中，应采用能够去除杀虫剂而不产生有毒副产物的微生物菌株，而不是产生有毒副产物的菌株⁴³。本研究结果表明，分离物ES-1能完全水解硫丹的两种异构体而不产生任何有毒副产物。因此，它是一种优良的生物增强剂。的芽孢杆菌sp ES-1可能含有降解这两种异构体的酶，有待进一步研究。

结论

硫丹异构体和硫酸硫丹对人体和环境都有毒性，在土壤中存在时间较长。本地细菌菌株芽孢杆菌发现sp.ES-1能完全降解硫丹。硫丹硫酸盐是一种中间化合物，通常在降解过程中积累，通常被认为比未检测到的母体化合物更具毒性和持久性。综上所述，ES-1菌株可作为高浓度硫丹污染土壤的生物增强剂。

鸣谢

作者感谢印度政府科学技术部(DST)-科学与工程研究委员会(SERB)为开展这项工作获得的资助(SB/EMEQ-041/2013)，以及迈索尔大学卓越研究所(IOE)提供气相色谱-质谱(GC-MS)。

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