马来西亚沙捞越美里休闲湖泊中微囊藻毒素(Mcye)基因的检测
Rohaslinda穆罕默德1,穆罕默德。Rafatullah1＊东姑娜迪亚·尤索夫1沈奕静1和Norli Ismail1
http://dx.doi.org/10.12944/CWE.11.3.02
有毒的蓝藻水华成为一个世界性的问题，因为许多国家在大多数水体中都遇到了水华的存在。作为在马来西亚发展蓝藻毒素监测的一部分，在砂拉越美里的五个不同湖泊的十二个点采集了样本。采用聚合酶链反应(PCR)法扩增蓝藻16S rRNA，检测水样中是否存在蓝藻。所有样品均检测到蓝藻16S rRNA。利用特异性引物对蓝藻毒素编码基因进行分子分析。采用正向引物组合对蓝藻毒素编码基因进行PCR扩增;mcyE-F2和反向引物;mcyE-R4扩增通用微囊藻毒素(mcyE)基因。在十二个样本中，微囊藻毒素(mcyE在其中一个测试样本中检测到产生基因。微囊藻毒素编码基因的存在表明砂拉越美里地区存在蓝藻毒素的风险。
有毒蓝藻;蓝藻毒素;蓝藻16S rRNA;PCR扩增;对国内外
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Mohamad R, Rafatullah M, Yusof T. N, Sim Y. J, Ismail N, Lalung J.马来西亚砂拉越美里休闲湖泊微囊藻毒素(Mcye)基因检测。当代世界环境，2016;11(3)。DOI:http://dx.doi.org/10.12944/CWE.11.3.02
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Mohamad R, Rafatullah M, Yusof T. N, Sim Y. J, Ismail N, Lalung J.马来西亚砂拉越美里休闲湖泊微囊藻毒素(Mcye)基因检测。当代世界环境，2016;11(3)。可以从://www.a-i-l-s-a.com/?p=16545
介绍
蓝藻，也被称为蓝绿藻，是具有独特特征的原核生物。与大多数原核生物不同，蓝藻细菌由叶绿素组成，叶绿素使它们主要通过光合作用获得营养。细菌的光合作用为其他生物提供大气氧气是很重要的。蓝藻作为可再生能源和天然产品的潜在资源也很重要。1然而，蓝藻的过度生长导致水环境中形成蓝藻华。这些花会引起一些问题，比如难闻的气味和味道，最重要的是，会产生毒素。2
弗兰西斯最早记录了蓝藻产生毒素的能力。3.然而，对毒素结构、基因组密码和生化途径的了解是在几十年后才知道的。蓝藻毒素编码在一个独特的基因簇，这不是物种特异性，而是基因特异性。也就是说，相同种类的蓝藻可能编码也可能不编码相同的毒素基因，并且相同的毒素可能由几个不同的物种编码。这些毒素根据毒理学作用大致可分为四大类，即肝毒性毒素(微囊藻毒素和结节素)、神经毒性毒素(anatoxin-a、anatoxin-a(s)和蛤蚌毒素)、细胞毒性毒素(cydrospermopsin)和皮肤毒素(plysiatoxin、lyngbyatoxin-A)。2，4，5
以前的记录表明，所有的毒素都对人类和动物有害。1996年，巴西116名患者在常规血液透析治疗期间直接接触蓝藻毒素，出现肝毒性和神经毒性症状，其中52人死于蓝藻中毒。这种症状现在被称为卡鲁鲁综合症。6已多次努力分析蓝藻毒素构成的健康风险，1999年，世界卫生组织(卫生组织)将蓝藻毒素列入饮用水准则和娱乐用水准则。
目前，全球已有泰国、越南、菲律宾、新加坡等65个国家在水环境中检测到有毒蓝藻，马来西亚于2015年确认存在有毒蓝藻7和产毒微胞藻属simyi Jing成功地从Penang的Ayer Itam水库中分离出该病毒。8
因此，检测毒素编码基因蓝藻是至关重要的，以澄清蓝藻毒素在马来西亚的地位。研究人员已经建立了许多有毒蓝藻检测方法。检测毒素编码基因最常用的方法是分子分型，如传统的聚合酶链反应(PCR)。采用PCR技术，对砂拉越美里地区存在的蓝藻毒素编码基因进行了研究。据我们所知，这是在马来西亚婆罗洲进行的首次检测编码微囊藻毒素的毒素基因的研究。
方法
抽样
这些地点涉及沙捞越的一个名为美里的地区。2015年6月，在米里附近的12个点采集了样本。这些湖泊分别位于塔曼东古、塔曼阿万美里、和美里城范、塔曼布拉丹和塔曼山顶(图1)。总的来说，这些湖泊是位于砂拉越美里的住宅和休闲区的人工湖。这些采样点是根据水体中绿色生物的可见性选择的，表明蓝藻的存在。在选择样本采集站点时还考虑了可达性和风向。
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DNA提取
根据细菌DNA提取试剂盒(Vivantis)方案从环境中提取DNA。简而言之，将1ml蓝藻样品以6000 rpm离心2分钟，并完全倒清。然后，在微球中加入100µl Buffer R1，将细胞完全重悬。细胞悬液中加入溶菌酶10µl。37℃孵育前将细胞悬液充分混合0C等20分钟。消化后的细胞在10000 rpm离心3分钟后，完全倒清。将微球重悬于180µl的缓冲液R2中，加入蛋白酶K。将细胞悬浮液充分混合，在摇热混合器中孵育20分钟。加入两体积的Buffer BG(约400µl)并多次混合，直到获得均匀的溶液。将混合物在65℃下孵育10分钟0C，然后加入200µl无水乙醇。然后将混合物转移到柱状显微液中。以10,000 rpm离心1分钟。排出的液用Wash Buffer洗涤。9以10,000 rpm离心1分钟。进一步在10,000 rpm下离心1分钟以去除残留的乙醇。最后，将提取的DNA洗脱到预热的洗脱液中。
通过琼脂糖凝胶观察DNA提取效率。提取的DNA保存在-20度，直到需要。
聚合酶链反应
采用引物对CYA106F、CYA781R (a)、CYA781R (b)检测蓝藻16S rRNA，引物序列如表1所示。10，11，12
表1:蓝藻16S rRNA扩增引物序列。
引物 |
序列(5 '到3 ') |
CYA106F |
CGG gg gg gg gg gg gg gg gg gg |
CYA781R (a) |
Gac tac TGG GGT atc TCC CTT t |
CYA781R (b) |
Gac tac agg GGT atc TCC CTT t tag |
*CYA781R引物为CYA781R(a)和CYA718R(b)的等摩尔混合物。
* 2条反向引物作为两种引物;CYA781R(a)和CYA718R(b)作用于形态不同的菌株，前者作用于丝状蓝藻，后者作用于单细胞蓝藻。13，14
采用Mastercycler®ep (Eppendorf)进行PCR扩增。PCR反应在25µL的反应混合物中进行，其中包括12.5µL 2X Taq Master Mix (Vivantis Technologies)， 0.25µL每种引物(Integrated DNA Technologies)和2µL DNA样品与无菌蒸馏的H20到总反应体积为25µL。扩增蓝细菌16S rRNA的PCR方案涉及在95°C下初始变性2分钟;然后是30个循环，每个循环为94℃60 s, 60℃60 s, 72℃60 s;在72℃下最终延长7min。10，15
扩增后，将产物载于1%琼脂糖凝胶上，该凝胶由0.25 g琼脂糖(Vivantis Technologies)加入25 mL 1 × TAE缓冲液制备。在热琼脂中加入2.5µL凝胶染色剂(TransGen Biotech)。PCR产物中加入2µL 6X上样染料(Vivantis Technologies)。凝胶在70 V下运行40分钟，使用Gel Doc进行观察TMXR + (Bio-Rad)。
通用微囊藻毒素(mcyE)基因用正向引物扩增;mcyE-F2结合反向引物;mcyE-R4。16，17而检测微囊藻毒素(mcyE)基因微胞藻属采用引物对mcyE-F2和mcyE-R8;18对国内外(mcyE)基因Anabena采用引物对mcyE-F2和mcyE-12R18和基因特异性Planktothrix采用引物对mcyE-F2和mcyE-plaR316．用于微囊藻毒素基因扩增的引物序列见表2。18
表2:用于扩增的引物序列mcyE基因
引物 |
序列(5 '到3 ') |
mcyE-F2 |
gggggggggggggtgc |
mcyE-R4 |
Aat TCT aaa GCC caa CG |
mcyE-R8 |
Caa TGG gag猫aac gag |
mcyE-12R |
Caa TCT CGG表示agc GGC |
mcyE-plaR3 |
CTC是CTG的总称 |
*引物mcyE-F2作为前向引物，扩增微囊藻毒素通用基因和特异基因。
为mcyE基因通用引物，PCR方案如下:第一步是95°C 2 min的初始变性步骤，然后是94°C 30 s, 56°C 30 s和72°C 60 s的35个循环，最后在72°C延长10 min。15，16
所有三个mcyE基因特异性引物的PCR协议涉及在95°C下初始变性3分钟。微囊藻毒素(mcyE)基因微胞藻属在94℃、60℃和72℃条件下分别进行30s、30s和60 s的25个循环。18而微囊藻毒素(mcyE)基因Anabena在初始变性步骤之后进行30个循环，分别为94℃30s、58℃30s和72℃60s18．微囊藻毒素(mcyE)基因Planktothrixsp.， PCR协议涉及30个循环，分别在94°C、57°C和72°C下分别为30秒、30秒和60秒16．所有PCR循环在72°C下最后延长10分钟。16，18
DNA纯化
PCR扩增的DNA产物基于Ambiclean试剂盒(PCR & Gel)协议(Vivantis Technologies)进行检测，并送往化学生物学中心进行测序。利用Blast将该序列与国家生物技术信息中心(NCBI)的现有数据进行比较。
结果
蓝藻16S rRNA的检测
将引物CYA106F与CYA781R (a)、CYA781R (b)结合扩增蓝藻16S rDNA，得到654 ~ 699 bp的DNA片段，如图2所示。
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所有样品凝胶电泳图像上显示明显条带，表明蓝藻16S rRNA存在(表3)，表明样品中存在蓝藻。
表3:2015年6月在砂拉越美里不同地点采集的蓝藻16S rRNA的PCR总结结果。“+”表示阳性结果，“-”表示阴性结果。
样品 |
结果 |
塔曼Tunku |
+ |
所有样品均检测到蓝藻16S rRNA基因阳性，表明样品中存在蓝藻。
通用微囊藻毒素(mcyE)基因
通用微囊藻毒素(mcyE)基因用引物mcyE-F2与mcyE-R4结合扩增，得到809- 812bp的DNA片段，如图3所示。
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只有Miri City Fan 1 (Lane 7)检测到微囊藻毒素基因(表4)，而其他样品在凝胶电泳图像中没有显示条带。
表4:泛型微囊藻毒素(mcyE)基因，用于2015年6月在砂拉越美里不同地点采集的样本。“+”表示阳性结果，“-”表示阴性结果。
样品 |
结果 |
塔曼Tunku |
- |
对国内外(mcyE)，而其他样本则显示阴性结果，表明缺乏微囊藻毒素基因。
微囊藻毒素(mcyE)基因微胞藻属sp。淡水藻类的一种sp.和Planktothrixsp。
对国内外(mcyE)基因微胞藻属sp。淡水藻类的一种sp.和PlanktothrixmcyE-F2与mcyE-R8 (微胞藻属sp.)， mcyE-12R (淡水藻类的一种)及mcyE-plaR3 (Planktothrixsp.)生成247bp的DNA片段，分别如图4、图5、图6所示。19，20.
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特异性微囊藻毒素基因的PCR扩增对国内外sp。淡水藻类的一种sp.和Planktothrixsp.在凝胶电泳图像中没有显示条带(表5)，表明未使用微囊藻毒素基因特异性引物扩增微囊藻毒素基因。21
表5:特异性微囊藻毒素(mcyE)基因对Miri (City Fan) - plankton样品进行了检测，结果显示通用微囊藻毒素阳性。“+”表示阳性结果，“-”表示阴性结果。
样本 |
毒素(mcyE)基因微胞藻属sp。 |
毒素(mcyE)基因淡水藻类的一种sp。 |
毒素(mcyE)基因Planktothrixsp。 |
米里城球迷 |
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进一步进行PCR扩增，确定产生微囊藻毒素基因的属。然而，检测微囊藻毒素(mcyE)基因微胞藻属sp。淡水藻类的一种sp.和Planktothrix结果为阴性。
在检测微囊藻毒素(mcyE)属特异性基因，将PCR产物清洗后送去测序，确定产生微囊藻毒素基因的属。利用BLAST将该序列与国家生物技术信息中心(NCBI)的现有数据进行比较。通过与NCBI现有数据的比较，该序列的相似度最高的是微胞藻属绿脓杆菌（mcyE)基因(5 ' -结果与GeneBank中可用序列相同66%。
讨论
蓝藻16S rRNA和微囊藻毒素基因在整个研究中都存在。在砂拉越美里的所有湖泊样本中均检测到蓝藻16S rRNA基因，但微囊藻毒素(mcyE)基因仅在12个不同的野外样本中检测到。2012年，哈里斯和哈桑22报告砂拉越色连兰禅池中存在蓝藻，共记录到17种蓝藻，其中6属为潜在产毒属;Cylindrospermopsis，念珠藻属，螺旋藻，颤藻属，Scytonema和聚球藻属．然而，并没有蓝藻毒素的报告。尽管蓝藻毒素有害，但在马来西亚的研究仍然有限。本研究是沙捞越游憩水中蓝藻毒素检测的第一步，也是重要的初步步骤。
热带国家的采样可以在一年中的任何时候进行，因为蓝藻可能全年都在繁殖。23然而，重要的是要考虑天气，如温度和风，以及蓝藻浓度的变化取决于风在一小时内。采样中蓝藻的不同浓度可能会提供不准确的数据，说明蓝藻对偶尔游泳的潜在毒性和可能进入饮用水的毒素量。2虽然蓝藻华是不可见的大部分时间，但蓝藻毒素的存在应该警惕和监测，因为毒素的生产是基因特异性的。
分析方法被广泛用于检测和定量蓝藻毒素，但毒素的半衰期很短，在环境中容易降解。因此，在本研究中，分子技术用于检测蓝藻毒素产生基因，因为产生毒素的能力是基因特异性的，而不是物种特异性的。在环境中，微囊藻毒素在化学水解和极高温(>300
的产毒基因检测微胞藻属，淡水藻类的一种,PlanktothixSp，研究人员的目标mcyE来自mcyS基因聚集在不同的引物目标上。25存在的mcyE基因会立即确认环境中存在有毒的蓝藻26作为mcyE基因编码3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基-4,6-十二烯酸(Adda)和谷氨酸-1-半醛转氨酶形成的重要蛋白质。这两种分子对毒性都很重要。27一项研究表明，毒性消失在Planktothrix发生时，高达90%的mcy基因簇丢失了。28然而，基因簇中基因间区域的缺失可能对毒素蛋白的表达没有影响。29随后,mcy大多数文献采用基因检测作为分子标记检测产生微囊藻毒素的蓝藻。
综上所述，在12份检测微囊藻毒素编码基因的样品中，只有1份样品检测到该基因。结果显示，Miri的一个湖泊存在潜在的蓝藻毒素风险。本研究表明，这是马来西亚婆罗洲首次检测到微囊藻毒素编码基因。所提供的数据对沙捞越的水风险管理和评估娱乐用水中潜在的毒素污染是有用的。
鸣谢
作者感谢马来西亚理科大学通过USM RU拨款和MOE ERGS拨款(资助号:1001.PTEKIND)提供资金支持。811253和203.PTEKIND.6730135)。
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