当前世界环境

介绍

有机磷农药最常用于农作物生产的虫害管理、城市卫生和病媒控制。¹毒死蜱[O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代盐]是广泛用于防治瘿蚊、蛲虫、玉米根虫、叶夹虫、叶跳虫等的广谱杀虫剂。²毒死蜱有多种配方，如颗粒、湿台式粉末、可粉尘粉末和可乳化浓缩物。^3.

毒死蜱的全面和大量使用和处理会污染空气、地下水、水体和土壤。过度使用农药导致农药残留在作物、土壤和生物圈中积累，造成生态压力。⁴环境保护局提交了许多关于毒死蜱污染水和陆地生态系统的报告。⁵研究人员报告说，pH值、温度、有机碳含量、水分含量和农药配方等因素的变化会影响毒死蜱在土壤中的半衰期，从10天到120天不等。3,5,6-三氯-2-吡啶醇(TCP)是毒死蜱的主要降解产物，具有比毒死蜱更大的水溶性，对土壤和水生环境造成广泛污染。⁶毒死蜱及其残留物已在海洋沉积物、农业土壤、溪流、河流、城市雨水渠、淡水湖、地下水、雾、雨和空气中被发现。⁷

由于毒死蜱对哺乳动物的高毒性和在农业部门的广泛使用，微生物对毒死蜱的降解尤其令人关注。生物降解被认为是一种可靠的经济有效的农药减排技术，也是决定环境中有机磷农药命运的主要因素。⁸Mallick等, 1999⁹报道称,节细菌属细菌在无机盐培养基中降解毒死蜱，这种细菌最初是从富含甲基对硫磷的土壤中分离出来的。采用富集程序¹⁰分离到6株毒死蜱降解菌。许多毒死蜱降解细菌，包括属的成员节细菌属sp。¹¹肠杆菌属应变B-14,¹²粪产碱杆菌属DSP3,¹³克雷伯氏菌sp．，¹⁴Sphingomonassp．Dsp-2，¹⁵假单胞菌绿脓杆菌NCIM 2074,¹⁶杆菌、C2A1,¹⁷假单胞菌putidaMAS-1,¹⁸Cupriavidussp。¹⁹已从农药污染的环境中分离出来。

本研究的主要目的是利用富集培养技术从苹果园土壤中分离和鉴定利用毒死蜱的细菌，并利用该细菌分离物在液体培养基中降解毒死蜱。本研究旨在阐明一种可能利用分离菌株修复毒死蜱污染环境的方法。

材料与方法

土壤样品采集

对印度喜马偕尔邦西姆拉县西奥格地点被各种农药污染的苹果园土壤进行了土壤样本采集，毒死蜱在该地区被广泛使用以防治各种害虫。采用消毒抹刀采集表层土壤样品，深度为10 ~ 15cm。^20.样本一式三份，送到实验室作进一步实验。

化学品和介质

毒死蜱(O, O-二乙基O-(3,5,6 -三氯-2-吡啶基)硫代盐)(纯度为99.6%)购于瑞士Sigma-Aldrich。甲基对硫磷样品(纯度为99.9%)来自美国Supleco Analytical公司。采用无机盐培养基(MSM)对毒死蜱降解菌进行富集、分离和鉴定。¹⁰MSM由(g/l) 1.5 g K2HPO组成₄， 0.5 g KH2PO4, 0.5 g (NH4)2SO4, 0.5 g NaCl, 0.2 g MgSO4, 0.05 g CaCl2, 0.02 g FeSO4, 1升pH 7.0的蒸馏水。灭菌通过在121°C和15 psi高压灭菌介质15分钟完成。

富集技术与分离

土样在室温下风干，含水量保持在20%左右(w/w)。这些土壤样品通过2毫米的筛网筛过。将10 g左右的土壤样品加入250 ml Erlenmeyer烧瓶中，其中含有50 ml含有10 mg/l毒死蜱浓度的无机盐培养基(MSM)。样品在37°C、150 rpm的摇床培养箱中黑暗孵育一周。培养1周后，将10 ml培养物转移到含有浓度为30 mg/l毒死蜱的新鲜MSM烧瓶中，再培养1周。再将1 ml培养物转移到含有50 mg/l毒死蜱的新鲜MSM中，在37°C和150 rpm下孵育一周。采用涂布平板法和条纹平板法分离毒死蜱降解菌和耐药菌纯培养物。将100µl富集培养物表面镀于添加50 mg/l毒死蜱的琼脂固化MSM玻璃培养皿中，37℃孵育24小时，培养基上出现菌落，分别进行条纹纯化，然后在4℃的MSM琼脂培养基斜面上保存，-20℃作为甘油储存。

细菌分离株毒死蜱抗药性分析

在含有不同浓度毒死蜱(50-800 mg/l)的无机盐培养基上对每一株选定的毒死蜱降解细菌进行条纹试验。²¹分离的细菌在添加了毒死蜱的MSM琼脂板上划线，在37℃下孵育48小时。然后选择在最高浓度毒死蜱下生长的细菌分离物进行进一步研究。

毒死蜱降解细菌分离物的特性研究

对具有最高毒死蜱浓度耐受性的纯化菌株进行了形态特征鉴定，并进行了甲基红与Voges-Proskauer (MR-VP)、过氧化氢酶、柠檬酸利用率、氧化酶、脲酶、酪蛋白水解酶、葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵等生化试验。从Bergey的系统细菌学手册中对分离菌进行了分类鉴定，并通过16S rRNA基因测序进行了进一步确认。基因组DNA提取试剂盒- mini (Real Genomics)用于提取所选分离株的总基因组DNA。采用纳米滴分光光度计(Nanodrop ND1000, Thermo Fisher Scientific, USA)定量DNA。采用通用引物27f (5- agagtttgatcctggctcag3，正向)和1492r (5'- ggttaccttgttacgactt -3'，反向)扩增16S rRNA基因。使用自动测序仪(遗传分析仪31030,Accessories Applied Biosystems)进行测序。使用EzTaxon服务器，鉴定系统发育邻居并计算配对16S rRNA序列相似性[22]。通过CLUSTALW对公共数据库中的数据进行多次比对，利用MEGA6软件包进行系统发育分析。²³

毒死蜱降解OPH活性的定量筛选

选择的细菌分离物进一步通过定量方法筛选有机磷酸盐水解酶(OPH)活性。将细菌细胞在1.0 l贝尔塔尼Luria Bertani (LB)培养基中培养过夜。分离菌隔夜培养，得到8000 × g, 4的培养上清^°C作用10分钟，进一步用作粗细胞外酶。洗涤细胞微球两次，然后在含有0.1 mmol/l苯基甲基磺酰氟(PMSF)的50 mmol/l Tris-Cl (pH 8.0)缓冲液中重悬。细胞破坏是通过声波10次，每隔15秒进行10秒，使用(数字声波- mp生物医学)。将未破碎的细胞在15000 × g下离心30分钟，得到的无细胞上清用作细胞内粗酶。细胞内和细胞外粗酶制剂用于进一步的定量分析。²⁴

将100 μl细胞内和细胞外粗酶制剂加入900 μl 50 mmol/l Tris-Cl (pH 9.0)测定缓冲液中，以5.0 μl 10 mg/ml甲基对硫磷为底物，在37℃下孵育10分钟。通过加入1.0 ml的10% CCl3COOH(三氯乙酸)结束反应，然后加入1.0 ml的10% Na2CO3显色。用Perkin Elmer Lambda 25光谱仪记录410 nm波长处的吸光度。根据金额p计算水解产物-硝基苯酚(PNP)和酶活性。一个单位的OPH活性定义为酶的释放量1.0 μmolp在37°C下每分钟-硝基苯酚。

分析性程序

接种物的制备

采用无矿盐培养基培养菌株AST2.2至指数相，室温下5000 g离心5 min。细胞微球用灭菌的MSM洗涤两次，并调整至约3x10⁸CFU/ml进行降解实验。

无机盐培养基(MSM)的接种与强化

100 μl含3x10的细菌培养悬液⁸将CFU/ml接种到含有含有400 mg/l毒死蜱的20 ml微量培养基的烧瓶中。以未接种的瓶为对照，瓶中含有少量培养基(含400 mg/l毒死蜱)。在37ËšC孵育不同时间间隔(0、24、48、72、96小时)。

提取和分区

采用液液萃取法提取细菌培养物中毒死蜱及其残留物。将含有培养物的毒死蜱转移到分离漏斗中，培养基中加入20 ml正己烷。将混合物大力摇晃4-5分钟，保持不受干扰，直到两种液体分离。样品提取三次，正己烷层收集于250 ml锥形烧瓶中。提取液在50℃旋转蒸发器上经真空泵加压蒸发至几乎干燥，残液在2.0-5.0 ml正己烷中再溶解，装于无菌玻璃瓶中进行气相色谱测定。

色谱测定

GC-FID分析采用岛津GC-17A气相色谱仪。柱尺寸为30 m × 0.25 mm，内径为Optima-5 (machery - nagel)毛细管柱。毛细管柱的组成为5%苯基- 95%甲基聚硅氧烷。分析在1:10的分割模式下进行。色谱柱和进样器温度分别保持在300℃和400℃，检测器温度保持在450℃。柱压77 kPa，柱流量1.0 ml/min，总流量12 ml，载气为氮气。¹⁸毒死蜱的回收率计算如下:

毒死蜱降解量=原添加量-回收量



气相色谱-质谱法测定毒死蜱中间体

GC-MS使用TRACE 1300GC TSQ 8000进行，该仪器装配有一个分裂-无分裂进样器，并连接到三重四极杆质谱仪。采用TG-5 MS毛细管柱(30 m × 0.25 mm, 0.25 μm，含5%苯基甲基聚硅氧烷)(J&W Scientific, Santa Clara, CA)进行分离。²⁵以氦气(99.99%)为载气，流速为1ml /min。进样器温度在250℃下保持无分裂模式(5分钟)，烘箱温度设定为:初始温度100℃(保持2分钟)，每分钟20℃至180℃，每分钟10℃至250℃(保持2分钟)。总GC-MS分析时间为15分钟。采用电子电离方式进行质谱电离，在70 eV下记录能谱。GC-MS界面设置为250℃，离子源温度设置为200℃。总离子电流(TIC)色谱图记录在40-500之间m / z．通过质谱(MS)与美国国家标准技术研究院(NIST-07)标准库的质谱数据进行比较，对GC后得到的各组分进行鉴定。

结果与讨论

本研究采用选择性富集法从有毒死蜱使用史的苹果园土壤中分离出毒死蜱降解菌。毒死蜱选择压力3周后，在含有50 mg/l毒死蜱的无机盐琼脂培养基上仅分离出3株细菌。许多研究人员报道了从土壤中分离出毒死蜱降解细菌和真菌的情况。^{12日,13日,26日2}很少有研究人员还报告从农药生产单位的污泥和废水中分离出毒死蜱降解细菌。^{15日,27日,19}

通过在添加不同浓度毒死蜱(50 ~ 800 mg/l)作为碳源和能量源的MSM培养基中培养，筛选出有效的毒死蜱降解菌分离物。分离物AST2.2能够耐受800 mg/l毒死蜱，并显示出高达400 mg/l毒死蜱的生长，因此该分离物被选择用于进一步的研究(表1)。先前研究人员的报告结果也观察到细菌可以耐受高浓度毒死蜱并在高浓度毒死蜱下生长。^21日,27日

表1:在不同浓度毒死蜱的无机盐琼脂培养基中，选定菌株对毒死蜱的抗性谱

菌株	毒死蜱在MSM琼脂中的浓度(mg/l)
	50	One hundred.	200	400	800
AST1.1	+	+	+	-	-
AST2.1	+	+	+	-	-
AST2.2	+	+	+	+	±

+ =生长，±=斑驳生长，- =无生长

菌株AST2.2菌落呈乳白色，圆形，纹理光滑，整个边缘。菌株AST2.2革兰氏阴性，呈棒状，严格需氧，无孢子形成，可运动。菌株AST2.2在过氧化氢酶、氧化酶、柠檬酸利用率、脲酶和葡萄糖发酵生化试验中呈阳性，但在乳糖和蔗糖发酵、吲哚利用、明胶液化、酪蛋白水解、甲基红和Voges-Proskauer生化试验中呈阴性。根据各种形态和生化特征，分离菌株ASK3.2被确定为该属成员假单胞菌通过Bergey 's《测定细菌学手册》中设定的标准方案。²⁸16S rRNA基因部分测序(1231bp)和BLASTn分析进一步证实了这一点，结果显示与种属的相似性超过99%假单胞菌．16S rRNA测序已被有效地用于细菌种类的分子表征。研究人员已经使用16S rRNA测序来鉴定毒死蜱降解细菌分离物。^{12日,10日,29日,27岁}

利用EzTaxon对16S rRNA基因序列进行分析，基于成对核苷酸相似性值和系统发育推断方法实现分离株的鉴定^点,22通过EzTaxon server鉴定菌株ASK3.2的16S rRNA序列为假单胞菌resinovarans16S rRNA序列与假单胞菌resinovoranslmg2274 (T)(加入号:Z76668)。AST2.2的测序结果已提交至GenBank国家生物技术信息中心(NCBI)数据库，获取的登录号为KP322753.1。树突图显示了使用philips进行16S rRNA分析的结果。

图1:的系统发育关系假单胞菌resinovaransAST2.2基于部分16S rRNA序列 点击此处查看图

假单胞菌resinovarans菌株AST2.2同时具有胞外和胞内有机磷水解酶活性。48 h后，细胞外OPH活性为0.157 U/ml，而细胞内OPH活性仅为0.068 U/ml。我们的结果与宁丰的结果是一致的等j .， 2004[24]，报告的OPHC2活性分别为0.208 U/ml和0.198 U/ml假单胞菌pseudoalcaligenes,从有机磷处理的土壤中分离得到。这表明OPH酶可能存在于AST2.2的细胞膜内或分泌于细胞外。以往的研究结果表明，OPHC2酶位于细胞的细胞膜上假单胞菌pseudoalcaligenes²⁴和OPH酶假单胞菌diminuta。³¹

采用配备火焰电离检测器(FID)的气相色谱法，对间隔24 h、间隔96 h的样品进行分析，采用岛津GC-17A气相色谱仪。使用液体MSM进行气相色谱研究，结果显示在表II和图II- vii中，表明残留毒死蜱的回收率。毒死蜱在无机盐介质中的降解结果与阿贾兹报道的结果一致等, 2012¹⁸在哪里假单胞菌putidaMAS-1用于降解。结果表明，随着时间的推移，毒死蜱残留回收率逐渐降低。

表2:接种的无机盐培养基中毒死蜱残留回收率假单胞菌resinovorans应变AST2.2

时间(小时)	标准RT 毒死蜱	标准峰高 毒死蜱	RT对 样本	样本峰高	毒死蜱回收率	退化量 (毫克)	退化百分比
0	16.03	542502.30	16.04	541329.30	99.78	0.018	0.22
24	16.03	542502.30	16.02	499401.66	92．00	0.640	8.00
48	16.03	542502.30	16.00	409507.40	75.40	1.968	24.60
72	16.03	542502.30	15.99	357849.18	65.96	2.723	34.03
96	16.03	542502.30	15.98	304361.51	56.10	3.512	43.90

对照样品(不含菌株)在留样时间RT 16.03时记录到毒死蜱标准峰，峰高542502.30。在试验样品中接种假单胞菌菌株AST2.2)，在RT范围为16.04 ~ 15.98，峰高随时间增加而降低，说明毒死蜱在MSM中用量减少。RT值随时间(0 ~ 96小时)的增加而降低。据透露假单胞菌resinovaransAST2.2快速降解毒死蜱，0 h后毒死蜱回收率为99.78%，96 h后毒死蜱回收率逐渐降低至56.10%。我们观察到，菌株AST2.2在MSM中生长的前24小时内不能利用/降解毒死蜱(表2)，因为菌株在接种培养基后可能处于较早的生长阶段。假单胞菌resinovarans该菌株以毒死蜱为底物，同时作为碳源和能量源，96 h后对毒死蜱400mg /l的降解率为43.90%。

肠杆菌属菌株B-14在48 h内降解40% 25 mg/l毒死蜱;¹²Stenotrophomonassp. YC-1在24小时内降解100% 100mg /l。¹⁰杆菌、菌株在5天内降解毒死蜱50 mg/l，残留农药9 mg/l¹⁷和集胞藻属菌株PUPCCC 64在5天内对5 mg/l毒死蜱的降解率为93.8%;³²这些菌株能够将毒死蜱水解成TCP。

图2:毒死蜱标准品的GC-FID峰，保留时间为16.03，峰高为542502.30 点击此处查看图

图3:毒死蜱的气相色谱- fid峰假单胞菌resinovarans应变AST2.2RT为16.04，峰高为541329.30 点击此处查看图

图4:毒死蜱24小时后的气相色谱- fid峰假单胞菌resinovarans应变AST2.2为16.02 RT，峰高为499401.66 点击此处查看图

图5:毒死蜱48小时后的气相色谱- fid峰假单胞菌resinovarans应变AST2.2与16.00 RT，峰高409507.40 点击此处查看图

图6:毒死蜱72h后的GC-FID峰假单胞菌resinovarans应变AST2.2与15.99 RT，峰高357849.18 点击此处查看图

图7:毒死蜱96小时后的GC-FID峰假单胞菌resinovarans应变AST2.215.98 RT，峰高304361.51 点击此处查看图

毒死蜱中间体的测定

降解研究结束后，采用气相色谱-质谱(GC-MS)技术对样品进行分析。总离子电流谱在40-500 m/z之间，扫描965次。对照样品和测试样品的碎片离子相似(96.9,196.9,285.9,313.9 m/z)。GC-MS分析显示，在对照样品中，毒死蜱的残留时间为11.13 min(图8)。李等[j] .， 2010[25]采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对地表水中的23种有机磷农药进行了测定，并报道了毒死蜱残留时间(RT)为11.41±0.01。通过与NIST-07质谱数据库标准库的比对，证实了待测样品在rt11.11时的质荷比与相对强度与毒死蜱标准谱相匹配(图ix)。一种可能的代谢物，即磷酸，二乙基3,5,6-三氯-2-吡啶酯(C₉H₁₁Cl_3.没有₄P)，编号为5598-15-2与毒死蜱在RT 11.11的测试样品中一起被NIST文库检索鉴定。GC-MS质谱分析结果表明，毒死蜱被进一步降解为较小的中间体，而这些中间体在现有的文库数据库中无法识别。在培养时间11.11 min时检测到毒死蜱的存在，但在培养时间15 min前未检测到毒死蜱的其他中间体。结果表明，毒死蜱可能被分离物完全代谢为较小的中间体。Kumar 2011,³³和Barathidasan等, 2014,³⁴在GC-MS分析后也报告了类似的结果，因为毒死蜱降解后的较小中间体没有被鉴定出来。

图8:毒死蜱对照(未接种)48h后的总离子电流色谱和质谱 点击此处查看图

图9:毒死蜱与水共孵育48小时后的总离子电流图谱和质谱假单胞菌resinovarans在无机盐培养基中培养AST2.2 点击此处查看图

结论

以生态恢复为目的，基于生物修复/生物降解的技术越来越受欢迎。假单胞菌resinovarans菌株AST2.2可用于毒死蜱污染土壤的生物修复

致谢

作者感谢索兰园艺与林业大学园艺学学院院长Y.S. Parmar博士的资助。

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