当前世界环境

介绍

水生环境中药物污染物的存在已成为人们日益关注的问题¹。药物污染物包括药物、重金属、染料、个人护理用品等，因其存在于水体中而被认为是新兴的环境污染物^2、3。目前，这些化合物在世界范围内的含量从ng/L到?g/L不等，但由于它们的生物活性潜力，可能会影响生态系统。随着生产和消费的增加，环境中出现了微污染物和个人护理产品。

在处理和未经处理的废水中最常发现的药物止痛药之一是对乙酰氨基酚(APAP;扑热息痛;N-acetyl-para-aminophenol)⁴。对乙酰氨基酚是一种需求量很大的非处方药。对乙酰氨基酚被用作退烧药、止痛药、解热药和镇痛药^5.对乙酰氨基酚从工业废水、用户使用和清理以及医院排放的水开始，通过多种排放途径不断进入水生环境^6、7、8。废水处理厂的目的是去除有毒物质，从而产生与母体分子相关的高度生态毒性的中间体或最终产品。

预计新冠肺炎疫情将对对乙酰氨基酚的使用及其在环境中的发生产生重大影响。在污水处理厂，先进的方法，如电化学氧化⁹过氧化氢/紫外线;过氧化氢/价/紫外线氧化¹⁰,臭氧化¹¹、光催化方法等¹²都是用来去除扑热息痛之类的药物。物理化学方法操作成本高，并且有可能产生有毒的中间产物或最终产物。生物处理可用于去除制药微污染物，以减少与其他方法相关的风险因素。对于生物方法，根据微生物的降解潜力、生物降解途径和培养条件选择微生物是必须研究的第一步。本研究旨在分离枯草芽孢杆菌用它来生物降解对乙酰氨基酚。

材料与方法

使用的化学品和样品的收集

对乙酰氨基酚标准品购自洛巴有限公司。利用制药废水分离对乙酰氨基酚降解物。这个样品含有未经处理的工业废水。5份样品在运往实验室的过程中保存在无菌容器中，然后在4°C下保存。这些样本被保存下来，用于沉淀像沙子这样的重颗粒和其他碎片。使用前将沉积物丢弃，上层水用于进一步试验。

富集、筛选、分离和鉴定APAP?降解菌

APAP降解菌株的分离按照Chopra和Kumar的方案进行，稍作修改¹³。在含有对乙酰氨基酚和废水样品的250 ml Bushnell Haas培养基(BHM)中进行APAP生物降解试验，室温孵育3天。用对乙酰氨基酚(100 -3000ppm)在营养琼脂平板和Bushnell Haas培养基上培养分离微生物。对对乙酰氨基酚表现出最大耐受性的分离物被用于进一步的研究。根据表型和基因型特征对分离的细菌进行分类。通过形态学、生化试验和16s rRNA测序方法进行鉴定。

发酵的研究

分离菌接种于Bushnell Haas肉汤(P_H7)含APAP的速率为2500ppm。室温下，黑暗条件下孵育4天，间歇测定细胞浓度(OD 600nm)， P_H比色法测定APAP残留浓度¹⁴。以扑热息痛100-1000 ug/mL的标准剂量响应曲线为参照进行计算。APAP的生物降解量由式1计算:

降解率(%)= (C0- ct)/C0 × 100 (1)

式中，C0为APAP的初步浓度;Ct为t时刻孵育后APAP的浓度。利用计算机辅助动力学评价(Computer Assisted Kinetic Evaluation, CAKE)程序对生物降解过程中的动力学参数进行了评价³⁴。

基于反相高效液相色谱的分析

将发酵的肉汤离心，收集上清。溶剂萃取采用甲醇。溶剂蒸发后，进行反相高效液相色谱处理。对乙酰氨基酚采用反相高效液相色谱(HPLC)等容模式洗脱，JASCO (250 × 4.6 mm，装5µ)。所用溶剂体系为甲醇:水(15:85)，流速为1 ml/min，监测波长为240 nm。

APAP降解代谢产物的鉴定

采用高分辨率质谱法(HR-MS)对APAP生物降解代谢物进行分析。采用Bruker Impact HD仪器对发酵液中提取的标准物及其生物降解代谢物进行质谱分析。在正离子模式双电喷雾电离源、扫描范围50 ~ 1200 m/ z、扫描速率4.0谱线/秒、源气温度200℃、气体流速7.01 l min-1、进样量10 μ l的条件下进行HR质谱分析。将雾化器压力调整到1.7 bar。数据分析采用Bruker compass数据分析4.2软件。

用趋化性试验筛选对乙酰氨基酚生物增强剂的生物降解

根据前面描述的程序，用滴板法定性地检测菌株对对乙酰氨基酚的趋化行为¹⁵。在培养基的琼脂表面涂上细菌接种物。将一小撮(5-10毫克)对乙酰氨基酚晶体放置在板孔(6毫米)中。室温孵育48小时。在化学物质附近的细菌生长被记录为积极的趋化反应。

结果

富集、筛选、分离和鉴定APAP?降解菌

用含有对乙酰氨基酚(100-3000mg/L)浓度的Bushnell Haas培养基富集对乙酰氨基酚降解菌。对乙酰氨基酚表现出最大耐受性的细菌培养物在营养琼脂板上传代培养。共获得23株菌株，但对具有较高APAP耐受性的菌株进行了进一步研究。

对2500 ppm浓度的APAP表现出耐受性的分离菌为革兰氏阳性杆状菌，菌落呈乳白色。经生化检测，分离物过氧化氢酶阳性，葡萄糖发酵，甲基红阳性，无孢子形成。采用16S rDNA测序法进行分子鉴定。分离物被发现是枯草芽孢杆菌无性系种群。枯草杆菌NCIB 3610(T)与EzBioCloud数据库相似度为99.86%。采用邻居连接法绘制系统发育树突图(图1)。

图1:基于16srRNA序列邻接分析的系统发育树状图。 点击此处查看图

发酵的研究

将分离物接种于含有对乙酰氨基酚(2500ppm)浓度的BHM培养基(pH 7)和1%接种量(10⁹cfu /毫升)。在室温下培养4 d，评价对乙酰氨基酚减量与细菌生长的关系。随着孵育时间的延长，肉汤呈现褐色至黑色，如图2所示。

图2 . A.的增长枯草芽孢杆菌在含有APAP的BH介质上。B。枯草芽孢杆菌发酵的BH肉汤(2500ppm APAP)由于氨基酚而呈现黑色。 点击此处查看图

图3:对乙酰氨基酚生物降解的时间过程效应枯草芽孢杆菌。 点击此处查看图

压力枯草芽孢杆菌降解73%的对乙酰氨基酚，生物量和Ph值增加，如图3所示。的特定增长率枯草芽孢杆菌在对乙酰氨基酚存在下生长时，用Monod模型计算为0.3499。利用计算机辅助动力学评价(Computer Assisted Kinetic Evaluation, CAKE)程序对生物降解过程中的动力学参数进行评价，结果如表1所示。

表1:有机酸降解APAP的动力学参数枯草芽孢杆菌

动力学模型	APAP即浓度	K (d1）	Chi-sq错误	DT50(天)	DT90(天)
简单一阶	2500 ppm	0.1	5.1	3.4	11.5

基于反相高效液相色谱的分析

采用反相高效液相色谱法，提取对乙酰氨基酚标准品和对乙酰氨基酚生物转化代谢物枯草芽孢杆菌sp.发酵肉汤如图4a和4b所示。在扑热息痛生物转化代谢物的HPLC图谱中，除了扑热息痛(保留时间6.4 min)外，还发现了一个未知代谢物，保留时间为2.217 min。枯草芽孢杆菌96小时后降解73.4%对乙酰氨基酚(2500ppm)。

图4a:黄芪提取物降解代谢物的HPLC图谱芽孢杆菌细小发酵肉汤(2500 PPM对乙酰氨基酚)。 点击此处查看图

图4b:标准品对乙酰氨基酚(Paracetamol)的HPLC图谱。 点击此处查看图

APAP降解代谢产物的鉴定

采用高分辨质谱法对甲醇提取的对乙酰氨基酚降解代谢物进行了鉴定。利用Bruker compass数据分析4.2软件，鉴定出4氨基酚(C6H7NO)的116.10峰为对乙酰氨基酚的生物降解产物(图5)。

图5:的HRMS枯草芽孢杆菌对乙酰氨基酚介导的生物降解代谢物。 点击此处查看图

用趋化性试验筛选对乙酰氨基酚生物增强剂的生物降解

的正向趋化行为枯草芽孢杆菌滴板法研究了对乙酰氨基酚的作用(图6)。滴板法结果显示，48小时后，对乙酰氨基酚晶体附近出现了细菌环。孵育表明菌株具有正向趋化行为，这是生物增强的主要要求。

图6:趋化性枯草芽孢杆菌对乙酰氨基酚。 点击此处查看图

讨论

枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性细菌，以其在生物修复中的潜在应用而闻名。对乙酰氨基酚等药物微污染物的生物降解因其成本低、效果好而引起了研究人员的广泛关注。细菌即。,红球菌属红的，Stenotrophomonas，假单胞菌moorei，Delftia tsuruhatensis，Cunninghamella echinulate,Shinella是否有报道对乙酰氨基酚具有生物降解潜力^16,17,18,19。在芽孢杆菌属,芽孢杆菌drentensis和蜡样芽胞杆菌有报道分别以300 PPM和200 PPM的速率降解对乙酰氨基酚吗^13日21。与报道的菌株相比，枯草芽孢杆菌NCIB 3610(T)在2500ppm的浓度下可以降解扑热息痛，产生更有生态毒性的最终产物4氨基酚。污水分离枯草芽孢杆菌应变DPP3 (MN744327)符合haldane生长动力学模型，最大比生长速率为0.259 (Hr)¹)在浓度为593 PPM的对乙酰氨基酚存在下，进行10天的降解潜伏期³³。扑热息痛生物降解途径包括对苯二酚1,2-双加氧酶、芳基酰基酰胺酶和脱氨酶的催化活性，生成4 -氨基酚和对苯二酚^{22日,23日,24日}。基于发酵研究和趋化性实验，枯草芽孢杆菌可用于药物污染地区的生物强化。基于导电聚合物/多壁碳纳米管的微生物生物传感器的应用枯草芽孢杆菌是否有报道称即使是低浓度的扑热息痛也有可能被检测出来²⁶。考虑到文献报道的对乙酰氨基酚使用微生物，它们的使用不仅限于降解污染物，而且有助于确定其浓度。

为了有效地处理制药工业废水，通常采用膜反应器进行生物增强处理，因为膜反应器中微生物应具有应对恶劣环境的潜力²⁷。报告了真菌增强的流化床颗粒生物反应器的适用性栓菌属多色的和曲霉属真菌luchuensis为了消除酮洛芬，美托洛尔和布洛芬²⁸。apap降解生物的生物增强;EnsiferPOKHU作用于活性污泥后，对乙酰氨基酚浓度降低，生态毒性随之降低²⁹。

在污水处理厂对乙酰氨基酚的生物降解过程中，微生物采取了药物内化、细胞表面吸收、酶辅助机制和生物-非生物耦合等不同的降解策略^30,31,32。由于药物微污染物的快速和广泛的生态毒性作用，需要立即从源头去除这些污染物。物理和生物过程相结合的方法将确保废水的解毒。

结论

对乙酰氨基酚是一种新兴的药物微污染物，必须采用经济环保的生物方法从水库中去除。根据目前的研究，可以得出结论，枯草芽孢杆菌具有耐受和降解高浓度对乙酰氨基酚的潜力。对乙酰氨基酚降解产物4氨基酚在染料工业中的应用前景广阔。在制药工业废水处理厂中，应重视将污染物降解为具有工业应用价值的产品。

确认

Meghmala Waghmode感谢Mahajyoti奖学金的经济援助。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

资金来源

这项研究工作没有得到任何外部资助。

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